Formulación de una microemulsión elaborada con keroseno y surfactantes mono-ramnolípidos

Se desarrolló una microemulsión estabilizada con biosurfactantes mono-ramnolípidos producidos en reactor de tanque agitado a partir de Pseudomonas aeruginosa ATCC9027 (cepa no patógena). La microemulsión fue elaborada con keroseno, agua destilada, monoramnolípidos y etanol como cosurfactante. Estos componentes fueron integrados con agitación mecánica y ultrasonido. El diámetro de gota analizado en TEM fue de 209 nm. El índice de cremación de 2.7% permitió verificar la estabilidad de la microemulsión.

Palabras clave: biosurfactante, cosurfactante, microemulsión, ramnolípidos.

ABSTRACT

Las microemulsiones son mezclas de líquidos inmiscibles estabilizadas por un surfactante y pueden ser del tipo aceite en agua (O/W) o agua en aceite (W/O) (Khan et al., 2011). Las características de estos fluidos son de interés para el suministro de agentes activos de tipo lipofílico (McClements et al., 2007). Las emulsiones se aplican en la elaboración de alimentos, bebidas, cosméticos y medicamentos, además de la desorción de contaminantes (Ashaolu, 2021). Por el diámetro de gota (Dg), son clasificadas en macro (Dg > 500 nm), micro o nanoemulsiones (Dg de 1-200 nm) (Tadros, 2014).

Los surfactantes pueden ser sintéticos y orgánicos, no obstante, dada la contribución a la contaminación ambiental de los sintéticos, surfactantes degradables de origen microbiano como los ramnolípidos están en curso de estudio. Éstos son generados por bacterias del género Pseudomonas, principalmente, y están constituidos por una o dos ramnosas unidas a una cadena de ácido graso no polar, cuya longitud dependerá de la especie de microorganismo que las produce (Randhawa y Rahman, 2014). Surfactantes ramnolípidos de una ramnosa son llamados mono-ramnolipidos; con dos, di-ramnolípidos.

El objetivo del presente trabajo fue la evaluación de la capacidad de una mezcla de mono-ramnolípidos derivados de Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, para microemulsificar keroseno. La emulsión formada podría tener aplicación en la solución de problemas de remediación de suelos contaminados con hidrocarburos.

MATERIALES Y MÉTODOS

Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 fue obtenida de la Colección Nacional de Cultivos Microbianos y Celulares del Cinvestav-IPN. La cepa fue propagada en caldo nutritivo (BD Bioxon) a 37°C y 150 rpm por 24 h (Innova 40 de New Brunswick Scientific), y recuperada por centrifugación a 10,000 rpm por 15 min (Allegra X-22R Centrifuge de Beckman Coulter) para su liofilización (liofilizador Labconco FreeZone 2.5) y posterior conservación a 4°C (refrigerador Nieto modelo RB630ANC). Los mono-ramnolípidos fueron producidos con el método reportado por Zhang et al. (1997), pero con glicerol a 3% (pureza 99%, High Purity) como fuente de carbono. Los mono-ramnolípidos fueron separados por extracción líquido-líquido con acetato de etilo (1:1) (pureza 99.5%, Química Rique). El surfactante fue purificado por cromatografía en columna (sílica gel activada, 60-200 Mesh, de J.T. Baker) y conservado a -76°C (Ultracongelador Thermo Scientific TSE320A modelo 931) (Guatemala-Hernández et al., 2021).

La microemulsión fue elaborada por un método de alta energía (agitación-ultrasonido) variando la composición de los diferentes componentes: mono-ramnolípido de 1.8 a 5.29%; etanol de 2.8 a 16%; keroseno de 1.1 a 10.4%; y agua desionizada de 60.9 a 91.1%. Los ramnolípidos en solución alcohólica (10%) (pureza >99.5% Química Rique) fueron mezclados (parrilla de calentamiento Heidolph MR Hei-Tec) con keroseno (1.1-10.4%) (J.T. Baker). Posteriormente se adicionó agua desionizada lentamente bajo condiciones de agitación (1,400 rpm) y aumento gradual de temperatura (de 45°C a 70°C) buscando observar un cambio en la textura de la emulsión, de opaca a transparente. Emulsiones de apariencia lechosa fueron tratadas posteriormente con ultrasonido (40 KW en ciclos de 4 min) (ultrasonic processor Hielscher UP200Ht).

La microemulsión fue analizada para determinación de pH (potenciómetro Eutech, Oakton, Vernon Hills, IL, USA), Dg (microscopía electrónica de transmisión, TEM), tipo de emulsión (test de tinción y fusión de gota) y estabilidad. El análisis TEM se realizó con muestras de microemulsión de 10 μL colocadas en rejillas de cobre y teñidas durante 1 min con ácido fosfotúngstico filtrado y ajustado a pH 7.0 (Lemus-de la Cruz et al., 2022). El exceso de líquido de las muestras se secó con papel de filtro Whatman y las muestras se observaron directamente en el TEM JEM-1400 (JEOL, Peabody, MA, EE. UU.). La estabilidad de la microemulsión se determinó a partir del índice de cremación. El análisis comprendió la centrifugación de las microemulsiones a 1,500 rpm durante 30 min. El índice de cremación se calculó a partir de la siguiente ecuación: %IC=(CC/CT)x100, donde CC es la altura de la capa de la crema y CT es la altura total del fluido.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

Producción de surfactantes mono-ramnolípidos

Los mono-ramnolípidos obtenidos de P. aeruginosa (ATCC 9027) fueron obtenidos en una concentración de 1.2 gramos por litro de medio de cultivo (g L-1). La estructura de estos surfactantes fue analizada por resonancia magnética nuclear y reportados en Guatemala-Hernández et al. (2021).

Keroseno emulsificado con mono-ramnolípidos

La variación porcentual de los diversos componentes empleados en la formulación de la micro-emulsión deseada dio lugar a los valores de Dg que se presentan en la tabla I. El menor Dg fue de 209.2 nm y fue obtenido con la formulación: mono-ramnolípidos, 1.9%; etanol, 15.2%; agua desionizada, 77%, y keroseno, 6% (%Rha/%Eth=0.13; %H2O/%Ker =12.8). El aumento de la relación %H2O/%Ker entre 12 y 34, para una relación %Rha/%Eth de 0.13 incrementó el Dg en 12%. Al aumentar la relación %Rha/%Eth, entre 0.13 y 1.7, para una relación %H2O/%Ker de 34, el Dg incrementó en 44%.

A pesar del estrecho rango de variación de los diferentes componentes de la microemulsión, la variación del Dg permitió observar la importancia de la concentración en que se adicionan los surfactantes mono-ramnolípidos en etanol (%Rha/%Eth). Este resultado podría atribuirse al papel del etanol, que actúa como cosurfactante y solvente en la mezcla de mono-ramnolípidos, ya que estos últimos son poco solubles en agua. En el papel de cosurfactante, el etanol facilita la formación de una capa monomolecular del surfactante alrededor de las gotas de aceite, evitando la coalescencia y la separación de fases (Gupta et al., 2016).

Forgiarini et al. (2008) reportaron que el tipo y la cantidad de alcohol determinarán el nivel de estabilidad de una emulsión, ya que los alcoholes muy hidrofílicos (de cadena corta) se solubilizarán preferiblemente en la fase acuosa, mientras que los alcoholes más lipofílicos (de cadena más larga) lo harán en la fase oleosa.

El desarrollo de una microemulsión demanda una cantidad de surfactante del orden de 20% (Ashaolu, 2021). En el presente trabajo, la baja concentración utilizada (1.9%) podría atribuirse a la estructura molecular de los mono-ramnolípidos, conformada por congéneres de diferente longitud de cadena de carbonos (Guatemala-Hernández et al., 2021). Se asume que estructuras moleculares variadas facilitan los procesos de desorción en los procesos de remediación de suelos contaminados con mezclas complejas de hidrocarburos (Saeedi et al., 2014). Nanoemulsiones preparadas con ramnolípidos en dosis de 23-% fueron reportadas por Bai y McClements (2016), y Al-Sakkaf y Onaizi (2023). Los primeros utilizaron como fase oleosa aceites vegetales y animales, en tanto que los segundos, hidrocarburos del petróleo. Los resultados obtenidos en el presente trabajo son congruentes con lo reportado por estos autores.

Figura 1. Microemulsión keroseno (6%), agua (76.9%), etanol (15.2%) y mono-ramnolípidos (1.9%) obtenidos de P. aeruginosa.

Se observó que el aumento de mono-ramnolípidos disminuye el tiempo de disgregación con ultrasonido del keroseno (figura 2), no obstante, el diámetro de gota estuvo determinado por otros factores: la relación %H2O/%Ker. Por ejemplo, en una acumulación de mono-ramnolípidos de 1.9%, el aumento en la relación %H2O/%Ker de 12.8 a 42.3, disminuyó el tiempo de disgregación de 39.5 a 25.5 minutos, sin embargo, el diámetro de gota incrementó de 209 nm a 257 nm; mayor tiempo de ultrasonido no generó cambios significativos. Para una concentración de mono-ramnolípidos de 3.8%, el diámetro de gota disminuyó de 223 nm a 216 nm al bajar la relación %H2O/%Ker de 34.9 a 23.6. El aumento adicional de mono-ramnolípidos de 3.7% a 5.2%, pero manteniendo constante la relación %H2O/%Ker en 34.5 no favoreció la disgregación del keroseno, por el contrario, aumentó el diámetro de gota de 223 nm a 325 nm.

Figura 2. Tiempo de disgregación de gota con ultrasonido (40 KW) en función de la concentración de la mezcla de mono-ramnolípidos. Entre paréntesis (%H2O/%Ker). En rojo, fuera del paréntesis, se indica el diámetro de gota de la microemulsión.

El índice de cremación se registró en porcentajes inferiores a 5%. La capa de crema en la superficie de una microemulsión es resultado de la concentración de las gotas más grandes y menos densas de la fase dispersa, que tienden a ascender debido a la gravedad. Singh et al. (2017) reportaron que a menor porcentaje de cremosidad, mayor estabilidad de la emulsión. El valor de 5% aquí determinado indica la estabilidad de la emulsión formada.

En la figura 4 se muestra una micrografía del análisis TEM de la emulsión de composición 1.9/15.2/76.9/6 (%Rha/%Eth/%H2O/%KER). La morfología circular de la gota es un indicador de la estabilidad de la emulsión preparada. El Dg calculado mediante el análisis TEM en todas las emulsiones preparadas (tabla I) estuvo en el rango 209 nm-325 nm, lo cual nos permite identificarlas como microemulsiones.

Figura 4. Análisis TEM de la emulsión de composición (%) 1.9/15.2/76.9/6 (mono-ramnolípidos/etanol/agua/ keroseno).

Surfactantes mono-ramnolípidos generados por la cepa no patógena Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027 permitieron microemulsificar keroseno en agua. Éstos son poco solubles en agua, por lo que fue necesario adicionarlos en etanol, solvente que jugó, además, el papel de cosurfactante. El keroseno es una mezcla compleja de hidrocarburos aromáticos y alifáticos de una larga cadena de carbonos, por tanto, su microemulsificación demandó aplicar ultrasonido al reducir el diámetro de gota hasta 209.2 nm. Se asume que este diámetro de gota es adecuado para la aplicación de la microemulsión en problemas de desorción de hidrocarburos sorbidos en partículas de suelo.