Se requieren dos para bailar tango: interacción de dos aminoácidos de Antennapedia con TFIIEβ para el desarrollo de patas en Drosophila

Las homeoproteínas dirigen el desarrollo embrionario de los organismos mediante la unión del homeodominio al DNA y su interacción con otras proteínas. Antennapedia (Antp) se encarga de formar patas y alas en el tórax e interactúa con TFIIEβ a través del homeodominio en D. melanogaster. En este trabajo mostramos que la interacción de únicamente dos aminoácidos de Antp con TFIIEβ son necesarios para la formación de patas. La función de estas interacciones contribuye al complejo y fascinante rompecabezas de la especificidad de los genes Hox en el control genético del desarrollo en Drosophila.

Palabras clave: desarrollo embrionario, Drosophila, homeoproteínas, regulación génica, interacción.

Drosophila posee ocho homeoproteínas que especifican las características morfológicas de la cabeza, los tres segmentos torácicos y los ocho segmentos abdominales que conforman el cuerpo de la mosca. Específicamente, la homeoproteína Antennapedia (Antp) se encarga de dar identidad al segundo segmento torácico, donde promueve el desarrollo del segundo par de patas y las alas de la mosca (Cásares y Mann, 1998). Se sabe que Antp interacciona con diferentes factores transcripcionales, y de particular interés ha sido su interacción con miembros de la maquinaria basal como BIP2 o TFIIEβ (Prince et al., 2008; Baeza et al., 2015). Recientemente, mediante ensayos de complementación bimolecular fluorescente (BiFC), determinamos que Antp interactúa con TFIIEβ a través de los residuos 32 y 36 en la hélice 2 del HD en cultivo celular e in vivo (Altamirano-Torres et al., 2018). La maquinaria basal es un grupo de factores transcripcionales que se encarga de reclutar la RNA polimerasa II para iniciar la transcripción de cualquier gen codificante y se encuentran y funcionan en todos los tejidos. Por el contrario, cada homeoproteína se encuentra en un tejido específico en el que inducirá la formación de estructuras corporales particulares.

La relación de las homeoproteínas con la maquinaria basal dada por interacciones proteína-proteína ha sido de gran importancia, ya que la regulación transcripcional ocurre principalmente sobre el ensamblaje de la maquinaria basal, y el estudio de estas interacciones nos permite ampliar el conocimiento sobre los mecanismos de especificidad funcional de las homeoproteínas. En nuestro laboratorio analizamos la interfase de interacción entre Antp y TFIIEβ para determinar su importancia funcional durante el desarrollo de Drosophila, y encontramos que sólo dos aminoácidos de Antp son necesarios para que ocurra esta interacción y permita la transformación antena-pata.

Previamente, en el laboratorio analizamos la interacción proteína-proteína de Antp con TFIIEβ mediante mutaciones en Antp para definir la región responsable de esta interacción (Altamirano-Torres et al., 2018), y encontramos que el HD es la región de Antp que interacciona con TFIIEβ. Como la estructura del HD consiste en tres hélices α(H1,H2yH3), y debido a que la H3 es responsable de la unión al DNA, se analizó el papel de las hélices 1 y 2 en esta interacción. Los resultados obtenidos mostraron que la interacción depende únicamente de dos aminoácidos en la hélice 2 del HD. Estos resultados fueron validados usando la doble mutante Antp, en la que se sustituyó la isoleucina 32 y la histidina 36 de la hélice 2 por alaninas. El cambio por alanina se seleccionó debido a su carácter neutro y a su predicción para estructurarse en hélices α, lo que permitiría mantener la estructura del HD y neutralizar químicamente las posiciones 32 y 36 de la hélice 2. De esta manera, con la doble mutante, logramos establecer que la falta de los residuos 32 y 36 no permite la interacción de Antp con TFIIEβ usando BiFC (figura 1A) (Altamirano-Torres et al., 2018).

Para responder la pregunta de ¿qué función puede tener esta interacción en el desarrollo de la mosca y qué importancia tienen esos dos aminoácidos en la hélice 2 de Antp?, realizamos el análisis mediante la generación de moscas transgénicas y cruzas genéticas. Con las cruzas podemos dirigir las proteínas de interés a cualquier tejido de la mosca y observar el efecto analizando el fenotipo producido. La presencia de las homeoproteínas en tejidos donde normalmente no se encuentran puede cambiar la identidad de manera dramática, cambiando un segmento por otro, lo que se conoce como transformaciones homeóticas.

Normalmente, Antp se encarga de formar patas en el tórax, pero cuando dirigimos esta proteína a las antenas, las transforma en patas, generando una mosca ¡con patas en la cabeza! (figura 1B). La transformación de antenas en patas es una función homeótica de Antp que utilizamos en el laboratorio para analizar su función ectópica y, además, definir la importancia de regiones proteicas, o como en este caso, la de los residuos 32 y 36 de la hélice 2 en la interacción Antp-TFIIEβ y en la transformación antena-pata.

Con el uso de cruzas genéticas expresamos Antp o la mutante doble (Antp) junto con TFIIEβ de forma ectópica, específicamente en las antenas de la mosca. La interacción con TFIIEβ causó una completa transformación de la antena, con estructuras características de una pata de insecto como fémur, tarso y uña (figura 1B). Sorprendentemente, cuando dirigimos a TFIIEβ y la doble mutante Antp a la antena no ocurre la transformación antena-pata (figura 1C). Es importante mencionar que la expresión de TFIIEβ por sí sola no tuvo ningún efecto en la transformación de la antena (Altamirano-Torres et al., 2018), por lo que estos resultados claramente muestran que la interacción de Antp con TFIIEβ es requerida para su función en la formación de patas ectópicas en la antena, y que la mutación de únicamente dos aminoácidos son clave para el correcto funcionamiento de Antp en Drosophila.

Figura 1. La interacción de Antp con TFIIEβ es necesaria para la transformación de antenas en patas en D. melanogaster. Las proteínas de interacción AntpHD y TFIIEβ se expresaron en la antena mediante cruzas genéticas. A) Antp y TFIIEβ interactúan a través de dos aminoácidos en la hélice 2 del HD de Antp. B) Antena normal (WT) de Drosophila. C) La interacción AntpHD-TFIIEβ indujo la transformación homeótica completa de la antena en una pata. D) La coexpresión de la doble mutante AntpI32A-H36A y TFIIEβ disminuyó drásticamente la transformación homeótica de la antena, con sólo un leve engrosamiento del tercer segmento. Los segmentos transformados se indican mediante líneas y leyendas en rojo (2, segundo segmento de la antena; 3, tercer segmento de la antena; Ar, arista).

Los resultados obtenidos concuerdan con los de otros laboratorios que han encontrado interacciones entre otros HD también con TFIIEβ, o con otros factores transcripcionales como Med19 (Boube et al., 2014). Dado que los residuos 32 y 36 en la hélice 2 de Antp están altamente conservados, y físicamente expuestos en la cara opuesta a la unión al DNA, éstos mismos podrían estar involucrados en la interacción de otras homeoproteínas con TFIIEβ. Tales interacciones muestran de forma muy clara la función dual del HD para interactuar otras proteínas a través de la hélice 2, y unirse al DNA mediante la hélice 3.

Nuestros resultados sugieren que la interacción de Antp con TFIIEβ contribuye a la regulación transcripcional que permite la actividad funcional de Antp, y surge la pregunta de cómo se lleva a cabo dicha regulación en conjunto con la maquinaria basal de transcripción. Sabemos que Antp se encarga de la formación de patas apagando genes de antena como Hth y Dll (Emerald et al., 2003), así que la interacción de Antp con TFIIEβ podría estar cooperando para el apagado de los genes de antena y el encendido de genes de pata (figura 2). Aunque es necesario llevar a cabo más experimentos para definir con claridad el mecanismo molecular de acción de esta interacción durante la transcripción génica, nuestros resultados sientan las bases para estudiar a la hélice 2 del HD como una región clave de interacción con otras proteínas. 

Figura 2. La interacción de Antp con TFIIEβ a través de los aas 32 y 36 de la hélice 2 regula transcripción génica. La hélice 2 del HD de Antp interactúa con TFIIEβ en la maquinaria basal de transcripción. Tal interacción podría, en primer lugar, servir como puente entre el promotor y el potenciador “enhancer” tejido-específico a los que Antp se une. Una vez dada, la interacción podría ser responsable de apagar a los genes de antena y encender los de pata para generar la formación de los apéndices en la mosca.

Bobbola, N., y Merabet, S. (2017). Homeodomain proteins in action: similar DNA binding preferences, highly variable connectivity. Curr Op in Genetics & Dev. 43:1-8. https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0959437X16301265