APLICACIONES DE LAS TÉCNICAS MOLECULARES EN INOCUIDAD ALIMENTARIA
Yessica Enciso Martínez*, Albani Itzigueri Rivera Ortega*
CIENCIA UANL / AÑO 23, No.104, noviembre-diciembre 2020
La inocuidad de los alimentos es la ausencia, o niveles seguros y aceptables, de peligro en los alimentos que pueden dañar la salud de los consumidores. Los peligros transmitidos por los alimentos pueden ser de naturaleza microbiológica, química o física. Y es fundamental mantener la inocuidad en cada etapa de la cadena alimentaria, desde la producción agrícola hasta el consumo (CDC, 2018). Según la Organización Mundial de la Salud, las enfermedades transmitidas por los alimentos constituyen una importante causa de morbilidad, mortalidad y un significativo impedimento al desarrollo socioeconómico en todo el mundo (OMS, 2017).
Los métodos microbiológicos utilizados comúnmente en la detección de estos patógenos tienen varias limitaciones, por ejemplo, requieren mucho tiempo, son laboriosos, carecen de especificidad y existe la falta de discriminación entre cepas patógenas y no patógenas (Gui y Patel, 2011). La detección y enumeración de microorganismos en los alimentos son una parte esencial de cualquier control de calidad o plan de seguridad alimentaria (López-Campos et al., 2012). Esta situación ha conducido al desarrollo de nuevas tecnologías para obtener resultados más precisos y rápidos, como el uso de métodos moleculares para caracterización microbiológica.
Las técnicas moleculares sirven para comparar el orden de los ácidos nucleicos de dos o más microorganismos, es decir, las características o polimorfismos genéticos. Esta composición permitirá reconocer las características específicas de cada microorganismo, cómo se relacionan y diferencian de otros. La hibridación de una sonda específica, el análisis de ADNr y la reacción de cadena de polimerasa fueron las primeras técnicas moleculares utilizadas, y a través del tiempo han sido perfeccionadas para ser más eficientes y accesibles (Angarita et al., 2017). Por lo cual, ha ido en aumento su uso para la caracterización de microorganismos patógenos que representan un problema a nivel mundial.
ENFERMEDADES TRANSMITIDAS POR ALIMENTOS: UN PROBLEMA A NIVEL MUNDIAL
Las enfermedades transmitidas por alimentos son un problema global, son la causa de enfermedades y morbilidad, lo cual genera perjuicios a los consumidores, un gasto económico para las familias y gobiernos y un impacto en la comercialización globalizada de productos. Esto ha generado un costo de 95,200 millones de dólares en pérdidas totales de productividad al año y 15,000 millones de dólares anuales en tratamiento de dichas enfermedades (Banco Mundial, 2018). En 2015, los alimentos contaminados ocasionaron 600 millones de casos a nivel mundial y 420,000 muertes (OMS, 2019). En México, en 2017, se presentaron 8,285 casos de intoxicación alimentaria bacteriana (Secretaría de Salud, 2017).
Se han identificado más de 250 enfermedades transmitidas por alimentos, la mayoría de ellas son infecciones producidas por una variedad de bacterias, virus o parásitos que penetran en el organismo a través del agua o los alimentos y pueden ser de carácter infeccioso o tóxico. Entre los principales agentes causales de este tipo de enfermedades se encuentran Campylobacter spp., E. coli y Salmonella entérica no tifoidea (OMS, 2015). En México, las principales enfermedades transmitidas por alimentos son la salmonelosis, la fiebre tifoidea y las intoxicaciones alimentarias por bacterias (Secretaría de Salud, 2017).
Las enfermedades transmitidas por alimentos son un problema de salud pública en todo el mundo. La incidencia ha ido en aumento debido a la globalización, los cambios de hábitos alimenticios, surgimiento de nuevas formas de transmisión, el aumento de la resistencia de los patógenos a los antimicrobianos y la heterogeneidad dentro de una misma especie (Sousa y Pereira, 2013). Las poblaciones más vulnerables son niños, mujeres embarazadas, ancianos y personas de escasos recursos, además se generan pérdidas económicas y grandes costos a los servicios de salud (Forero et al., 2017). Por esto es importante la identificación de cepas causantes de brotes infecciosos, detectar la transmisión cruzada de patógenos, determinar la fuente de infección y reconocer cepas particularmente virulentas de cada especie (Rodríguez et al., 2009).
DESVENTAJAS DE LAS TÉCNICAS CONVENCIONALES PARA LA DETECCIÓN DE PATÓGENOS
Los métodos de diagnóstico convencionales se basan en la capacidad de crecimiento de los microorganismos en condiciones artificiales. En general, las muestras implican el cultivo en medios de preenriquecimiento y enriquecimiento, o placas de agar selectivas, para detectar o aislar especies microbianas específicas, y se complementan con pruebas bioquímicas, morfológicas o serológicas para su confirmación (Dinesh y Ambarish, 2009; Mandal et al., 2011). Estos métodos son muy sensibles, fácilmente adaptables, económicos y se puede obtener información cualitativa y cuantitativa sobre las poblaciones microbianas presentes en la muestra (Sousa y Pereira, 2013). Sin embargo, las muestras provienen de cultivos mixtos de microorganismos que pueden incluir varias especies patógenas, pero también flora normal. En la mayoría de los casos se deben realizar procedimientos de aislamiento para obtener cultivos puros y los resultados se obtienen en 1-3 días y hasta 7-10 días para la confirmación (Dinesh y Ambarish, 2009; Mandal et al., 2011). Por lo tanto, se requiere mucha mano de obra y mucho tiempo para la identificación de microorganismos.
El análisis microbiológico de los alimentos sigue siendo una tarea difícil para prácticamente todos los ensayos y tecnologías, especialmente para las especies patógenas particulares. Los problemas pueden deberse a la complejidad de las matrices y composición de los alimentos, la distribución heterogénea de bajos niveles de patógenos, el estrés sufrido por los microorganismos durante el procesamiento de los alimentos, la presencia de bacterias de la microbiota normal, especialmente en alimentos crudos, y las poblaciones microbianas pueden abarcar células senescentes o latentes que son viables pero no cultivables, debido al procesamiento al que se sujeta el alimento, lo que imposibilita el uso de los métodos de cultivo como herramienta de diagnóstico (López et al., 2012; Palomino y González, 2014). Por lo que el uso de métodos moleculares puede ayudar a contrarrestar estos inconvenientes, esto representa alternativas rápidas y sensibles para la detección de microorganismos.
MÉTODOS MOLECULARES UTILIZADOS EN LA IDENTIFICACIÓN DE PATÓGENOS TRANSMITIDOS POR ALIMENTOS
En la actualidad, los métodos moleculares para la identificación de microorganismos patógenos en alimentos son muy importantes debido a que presentan gran especificidad, sensibilidad, rapidez y, además, pueden ser automatizadas. El uso de métodos moleculares ha permitido la identificación de nuevos microorganismos presentes en los alimentos, así como el estudio de poblaciones microbianas sin aislamiento previo y la detección de microorganismos altamente patógenos. Las técnicas moleculares son de gran utilidad para el reconocimiento de brotes originados por alimentos contaminados con patógenos, las cuales permiten la identificación de las probables fuentes de contaminación, hasta llegar a su reservorio y las vías de transmisión (Boric, 2008).
Los primeros métodos de identificación molecular fueron la hibridación con una sonda específica, el análisis de secuencias del ADNr 16S, la hibridación ADN-ADN y el análisis del polimorfismo de longitud de fragmentos de restricción. La identificación por medio de técnicas moleculares se basa en la composición constitutiva de los ácidos nucleicos. Cabe mencionar que hay otras técnicas que han demostrado buenos resultados en la detección e identificación de microorganismos patógenos en los alimentos, como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), biosensores, electroforesis en gel en campo pulsado (PFGE), microarreglos, la pirosecuenciación 454, entre otros (Palomino y González, 2014). Cada vez es más fácil la utilización de este tipo de técnicas, algunas además de ser utilizadas en el laboratorio también pueden usarse en sitios de observación, lo cual les da una gran ventaja frente a las técnicas convencionales para la identificación de los microorganismos patógenos en los alimentos.
APLICACIONES DE LAS TÉCNICAS MOLECULARES EN INOCUIDAD ALIMENTARIA
Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
En el diagnóstico molecular microbiológico es utilizada para el recuento de patógenos transmitidos por alimentos. La reacción en cadena de la polimerasa es una técnica en la cual, a partir de una copia de ADN a amplificar, se obtienen millones de copias, lo cual permite su detección; actuando varias proteínas necesarias para la síntesis de nuevas hebras de ADN. Es una técnica fácil y rápida de utilizar, se requieren de 2 a 3 horas para llevarla a cabo. Existen varios tipos de PCR que son utilizados en la identificación de microorganismos patógenos en alimentos entre los que se encuentran PCR-estándar, PCR-anidada, PCR-in situ, PCR-ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (PCR-ELISA), PCR-transcripción reversa (PCR-RT), entre otras (Mas, 2016).
La PCR anidada comprende dos rondas de amplificación con diferentes pares de primers en cada una. Primero se realiza una reacción con los primers externos para amplificar una región de DNA más extenso, que contiene el segmento diana. Posteriormente, con este producto de amplificación, se ejecuta una segunda PCR con los internos para amplificar la región específica. La especificidad aumenta porque los primers sólo hibridarán en un sitio dentro de la molécula y el resultado será una única banda (Camacho, 2017). La PCR in situ consiste en una reacción de PCR en secciones de células, donde los productos pueden visualizarse en el sitio de amplificación y se realiza sobre preparaciones fijas en un portaobjetos. En la técnica se efectúa una primera amplificación de ADN blanco y una detección mediante hibridación in situ convencional con sondas de ADN/ARN (Martínez y Silva, 2004). La PCR-RT se utiliza para estudiar la expresión de ciertos genes de interés realizando la amplificación partiendo del ARN. PCR-ELISA implica la incorporación de nucleótidos marcados químicamente en el amplicón de PCR y posteriormente la detección del producto de PCR con el complejo de anticuerpo-enzima que reconoce el marcador químico presente en los nucleótidos incorporados (Hong et al., 2003).
Existen pruebas comerciales de PCR para patógenos relacionados a alimentos (Salmonella, Listeria monocytogenes, E. coli O157:H7, Campylobacter, entre otros). Se han utilizado pruebas basadas en la PCR en tiempo real para la identificación de E. coli en alimentos como hamburguesas y brochetas de carne, la técnica se llevó a cabo en un promedio de 24 horas. A su vez, también la PCR-RT se ha utilizado en carnes y productos cárnicos para la detección de Salmonella spp. Asimismo, se han utilizado pruebas de PCR para la identificación de Listeria monocytogenes en leche y productos lácteos (Gouws y Liedemann, 2005). Kasturi y Drgon (2017) analizaron 1741 muestras de diferentes empresas dedicadas al procesamiento de alimentos, en las cuales lograron detectar, con PCR-RT, 55% más positivos de Salmonella spp. que utilizando el ensayo de enzimoinmunoanálisis (VIDAS-Vitek®). También se ha utilizado PCR-RT en conjunto con un pretratamiento para la detección de células viables, pero no cultivables de E. coli O157:H7 en agua embotellada y lograron excluir el efecto de las células muertas (Cao et al., 2019). La técnica de PCR múltiple permite la detección simultánea de varios agentes patógenos en un alimento, por ejemplo, se utilizó este tipo de técnica en muestras de alimentos permitiendo la identificación de 11 especies bacterianas distintas y Helicobacter pylori (Kawasaki et al., 2005). Esta técnica permite una identificación más rápida y específica de los patógenos asociados a los alimentos.
Biosensores
Los biosensores están recubiertos con una capa de reconocimiento bacterial que puede ser un anticuerpo, ADN, enzima o combinaciones entre ellos. Los cuales se unen a los microorganismos de la muestra analizada, esto ocasiona modificaciones electroquímicas que pueden medirse como una señal. Su intensidad es directamente proporcional a los niveles de patógenos (Hakovirta et al., 2008). Los biosensores han sido aplicados en la detección de patógenos presentes en alimentos debido a que pueden detectar varios tipos de bacterias patógenas. Se ha desarrollado un biosensor para la detección de patógenos en carne (Campylobacter, E. coli y Salmonella), el cual permite realizar pruebas de control rápidas y sensibles en la planta de procesamiento de dichos productos (Kawasaki et al., 2005). Li et al. (2012) propusieron una estrategia rápida y sensible para la detección de Salmonella integrando la extracción simple de ADN y PCR con un sensor de ADN electroquímico basado en el gen invA, se logró detectar S. Typhimurium en un rango de 10 a 105 UFC/mL sin necesidad de preenriquecimiento. En 2018, Hashemi y Forouzandeh diseñaron un nuevo biosensor que puede detectar directamente el ADN de las bacterias, este método no requiere amplificación, tiene alta sensibilidad y es un sistema rápido en comparación con los métodos convencionales (4 h). Los biosensores pueden basarse en ADN, enzimas, anticuerpos y receptores, los cuales les permiten la detección de patógenos como Bacillus cereus, Campylobacter, E. coli, Salmonella Typhimurium, entre otros. Ha demostrado ser un método eficiente y rápido en la identificación de patógenos.
Microarreglos
Los microarreglos son un conjunto de sondas moleculares (oligonucleótidos sintéticos, clones de ADN o productos de PCR) fijadas sobre un soporte sólido (portaobjetos, Gene-chip o chips microelectrónicos). Se purifica el ácido nucleico, posteriormente se realiza su marcado (radioactivo o fluorescente), se procede a su hibridación y lavados, se realiza la medición de la señal utilizando un escáner (Doménech y Vila, 2014). Varios microarreglos se han desarrollado para los patógenos implicados en brotes transmitidos por alimentos. Se han utilizado microarreglos para la detección y caracterización de bacterias patógenas como Yersinia, Campylobacter y Salmonella en carne de cerdo (Palomino et al., 2014). En otras investigaciones se han utilizado para identificar 23 patógenos presentes en alimentos, siendo una gran ventaja de este método que permite amplificar el ADN de diferentes microorganismos en una sólo muestra (Wang et al., 2008). En un ensayo de microarreglos se distinguió a Yersinia pestis y Bacillus anthracis de otras especies bacterianas probadas experimentalmente y se identificaron correctamente las sondas de oligonucleótidos específicas de Y. pestis usando ADN extraído de muestras de leche inoculadas. Los resultados sugieren que puede ser una herramienta de diagnóstico potencialmente útil para detectar y confirmar la presencia de bacterias en los alimentos (Goji et al., 2012).
Electroforesis en gel de campo pulsado
La electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE) se ha utilizado para la caracterización de Campylobacter jejuni, Listeria monocytogenes, Salmonella, Shigella, E. coli O157:H7, Vibrio cholerae, entre otros patógenos transmitidos por alimentos. En la actualidad, la PFGE es considerada como el estándar de oro para la producción de huellas dactilares de ADN para un aislado bacteriano. Este método consiste en la separación de moléculas grandes de ADN alternando la dirección de la corriente eléctrica de una manera pulsada. Se han desarrollado protocolos de PFGE específicos para cierto tipo de bacterias, por ejemplo, en el PulseNet se pueden encontrar protocolos de bacterias patógenas transmitidas por alimentos (Campylobacter jejuni, Vibrio cholerae, E. coli O157, Salmonella, entre otras). PulseNet es una red nacional de Estados Unidos que conecta los casos de enfermedades transmitidas por alimentos para detectar brotes, utilizando PFGE como una herramienta para la detección de las bacterias patógenas (CDC, 2019). Este método es útil en investigaciones de brotes trasmitidos por alimentos. Se ha realizado la tipificación por medio de PFGE de cepas de Campylobacter aisladas de alimentos de origen animal (cerdo, aves de corral, pavo, ovejas y corderos) relacionadas con brotes originados por el consumo de este tipo de alimentos (Silva et al., 2016; Lahti et al., 2017).
CONCLUSIONES
Las técnicas moleculares presentan mayor ventaja frente a las técnicas convencionales de cultivo para la detección e identificación de microorganismos patógenos presentes en alimentos, son más específicos, sensibles y se realizan en menor tiempo. Por lo cual han ido en aumento en los últimos años, permitiendo una mejor detección e identificación de los microorganismos patógenos en alimentos. Se ha incrementado el uso y diversificación de métodos moleculares en microbiología de los alimentos, permitiendo escoger cuál es el mejor en la identificación de un patógeno en particular. Por lo cual, se propone la estandarización y validación de los métodos moleculares utilizados para la identificación de microorganismos patógenos en alimentos debido a que existen pocas investigaciones respecto a ello.
* Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A.C.
Contacto: yessica.enciso.mc18@ estudiantes.ciad.mx
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