Filogeografía (Herichthys, Perciformes: Cichlidae), nuevos: género (Nosferatu) y especie H. tepehua

04/01/2016

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MAURICIO DE LA MAZA BENIGNOS*, CLAUDIA PATRICIA ORNELAS GARCÍA**, MARÍA DE LOURDES LOZANO VILANO***, MARÍA ELENA GARCÍA RAMÍREZ***, IGNACIO DOADRIO****

CIENCIA UANL / AÑO 18, No. 76, NOVIEMBRE-DICIEMBRE 2015

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La tribu heroini forma el segundo grupo monofilético más grande de cíclidos neotropicales, se distribuye desde la provincia de Buenos Aires, Argentina, hasta la cuenca del río Bravo en América del Norte.

Esta tribu incluye los herichthyines, representados por los géneros Paraneetroplus y Vieja, como lo reportaron McMahan et al., (1) Herichthys, Paratheraps, Theraps, Tomocichla y Thorichthys, junto con un “género sin nombre”. (2-4)

Algunos factores que han obstaculizado hasta ahora el análisis, tanto filogenético como morfológico, a nivel intragenérico incluyen alta diversidad de taxón, amplios intervalos de distribución, plasticidad fenotípica y taxones que “provocan que conjuntos de caracteres sean inadecuados para revelar relaciones”. (3-6)

El cambio climático en los últimos 4 millones de años incluye el fin del período templado (7) con precipitación invernal más alta, condiciones más frescas y húmedas durante el Pleistoceno y el Holoceno temprano, en el norte de México. (8,9) Se propone que tanto el neovolcanismo como el cambio climático jugaron grandes papeles en la diversificación temporal y espacial.

El objetivo de este estudio implica revisar la historia evolutiva del género Herichthys, observar sus relaciones filogenéticas, así como los patrones temporales y biogeográficos asociados mediante la caracterización de variaciones morfológicas y estructura; se propone una hipótesis biogeográfica para el grupo.

MÉTODOS

Los especímenes del género Herichthys (3,10,11) y especies nominales representativas del género se colectaron con anzuelos y redes de pesca. El tamaño de la muestra de 20 ejemplares por localidad se basó en el estado de conservación de las especies conforme a la NOM-059. (12) Los especímenes colectados se fijaron en formol a 10%, luego transferido a isopropanol a 50%; y finalmente, depositado en la Colección Ictiológica de la Facultad de Ciencias Biológicas de la UANL. Para el estudio genético se tomaron las aletas pectorales, se preservaron en etanol a 95%, y se depositaron en el Museo Nacional de Ciencias Naturales de Madrid, España (MNCN).

Morfométrica y merística

Se tomaron 55 características biométricas (13 merísticas y 42 morfométricas) a 279 ejemplares en total. Las medidas se tomaron en mm y en las diagnosis y descripciones se expresan en porcentaje de la longitud patrón (LP) o la longitud cefálica (LC). (13,14) Tres especímenes de cada población, excepto N. steindachneri (1), N. bartoni (1 placa faríngea) y H. minckleyi (0), se removieron los tractos digestivos y placas faríngeas inferiores. El número de dientes en el margen posterior y el eje medio de la superficie occlusal se contaron bajo los criterios de Taylor y Miller, (14) Snoeks (15) y Chakrabarty. (16) Los datos de ecología y distribución se tomaron durante las colectas (2005-2007).

Se analizaron los componentes principales (ACP) y la función discriminante (AFD) al conjunto de datos morfométricos con el software StatistiXL vers. 1.7. Las medidas se estandarizaron para remover la alometría, con la ecuación Ms=Mo(Ls/Lo)b. (17,18) Se examinó (a) la morfología de los caracteres observables: (b) pigmentación reproductiva; (c) anatomía del tracto digestivo y (d) ecología.

Extracción de ADN, amplificación de PCR, y secuenciación

El ADN genómico se aisló de las aletas, con proteinasa K estándar y métodos de extracción de fenol/cloroformo19 y se resguardó a 4°C. El ADN se amplificó por el gen citocromo c subunidad de oxidasa I (Cox1, 585 bp), vía reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El proceso de amplificación fue bajo las condiciones de temperatura: 95°C (5 min), 35 ciclos a 94°C (45 s), 54°C (1 min), 72°C (90 s) y 72°C (5 min). Los PCR se realizaron en 10-1 reacciones, con 0.4 mM de cada “primer”, 0.2 mM de cada Dntp, 2mM MgCl2, una unidad de ADN polimerasa Taq (Invitrogen) y 10 ng de la plantilla de ADN. Los productos del PCR se ejecutaron en 1% gel de agarosa, para confirmar la amplificación, y se purificaron con el equipo EXOSAP-IT PCR Product Clean-Up (Usb). Ambas cadenas se obtuvieron mediante el secuenciador de ADN automatizado ABI PRISM 3700 (Applied Biosystems).

Análisis de datos

Los cromatogramas y alineamientos se revisaron visualmente y se verificaron en MEGA5. (20) Para las inferencias filogenéticas se aplicó un modelo separado de mejor ajuste para cada posición de codón por gen. El modelo evolutivo de sustitución de nucleótido se estimó con el criterio de información de Akaike corregido (AICc) y el criterio de información Bayesiano (BIC), como se implementó en el programa jModeltest. (21)

Los haplotipos del conjunto de datos se conformaron de 149 individuos, 146 grupo interno (69 de este estudio + 77 secuencias de GenBank) y nueve secuencias del grupo externo de GenBank se estimaron con DnaSP 5.0.22 Se generó una red unificadora de medidas con ilustración de las frecuencias de los haplotipos, cono NETWORK v 4.5.1.6. (23)

Se planteó una hipótesis filogenética bajo la estimación de máxima verosimilitud (ML) y se implementó con RAXML. El programa realiza una búsqueda heurística con el modelo general de tiempo reversible (GTR), que permite la partición de datos, y produce valores de verosimilitud a partir de GTRCAT; una aproximación GTR con optimización de tasas de sustitución individual por sitio y clasificación de aquellas tasas individuales a un cierto número de categoría de tasas.

La Inferencia Bayesiana (BI) se realizó con MrBayes versión 3.1.2, (24) con el modelo de mejor ajuste en BIC por partición de codón. Las ejecuciones BI fueron con ocho cadenas de Markov Monte Carlo (MCMC), 10 millones de generaciones, muestreando cada mil pasos. Los primeros 1000 árboles fueron descartados como burn-in. Con el programa Tracer v 1.4 (25) se evalúo la convergencia de ejecución y determinar los burn-ins.

Los tiempos de divergencia entre linajes mitocondriales principales se estimaron con un enfoque coalescente-Bayesiano como fue implementado en BEAST 1.6.1. (26) Para el análisis, se consideró el gen mtDNA (Cox1) y se usó la matriz de 31 haplotipos y 585 bp. Se aplicó un reloj molecular lognormal-relajado sin correlaciones, con el modelo SRD06 de sustitución nucleótido. (27) Debido a la ausencia de registros fósiles o datos geológicos, las estimaciones de edad se calibraron con una distribución a priori uniforme para el parámetro de tasa media de mutación de 0.8%/Ma, con valores inferiores y superiores de 0.5-1.2% por cada millón de años, basado en lo que se ha reportado en otra ictiofauna dulceacuícola para loci mitocondriales (2,28-34)

La prueba AMCMC fue ejecutada por 30 millones de generaciones para optimizar la escala de factores de la función a priori. Se revisó burn-in, convergencia y estacionariedad de los diferentes análisis en Tracer 1.5.

Demografía histórica

Los patrones de demografía histórica se inferieron a partir de estimaciones del tamaño de la población efectiva en el tiempo, con el método Skyline Plot Bayesiano (BSP), como fue implementado en BEAST v. 1.5.4. (26) Este método estima una distribución de los tamaños de población efectiva a través del tiempo, vía procedimientos de MCMC, moviéndose hacia atrás hasta que el tiempo del ancestro común más reciente se alcanza. Aplicamos diez grupos de intervalos coalescentes (m), y “primers” para el modelo filogenético. Con el modelo HKY + L evaluamos la heterogeneidad a lo largo de todas las ramas, particionando por posiciones de codón, al separar terceras de primeras y segundas posiciones, asumir un reloj molecular estricto, y con una tasa uniforme con un valor inicial de 0.8% de mutación por Ma, con intervalos inferiores y superiores de 0.5-1.2%, respectivamente. (2, 33, 35)

RESULTADOS

Los resultados del gráfico del análisis morfométricos, el ACP agrupado de 42 variables estandarizadas, de PC1 contra PC2, explica 44.3% de la variación total en la forma entre los especímenes, y proporciona una clara separación entre las dos agrupaciones de puntos, cada una correspondiendo a especímenes de Herichthys y del nuevo género Nosferatu. La base de la aleta pélvica, la base de la aleta pectoral, altura máxima y LC fueron las variables que más contribuyeron a las diferencias en PC1. La longitud de la mandíbula, la distancia desde la aleta dorsal hasta el origen de la aleta anal, la distancia desde el origen de la aleta anal hasta la base hipural y la base de la aleta anal contribuyeron a las diferencias en PC2. Además, el AFD de la base de datos morfométrica clasificó correctamente 99% de Herichthys y 100% del nuevo género Nosferatu.

La edad estimada del grupo interno analizado (Herichthys + Nosferatu n. gen.) es aproximadamente 7 Ma (~5 a 11 Ma 95% HPD). Esta divergencia inicial fue seguida por la separación entre ambos géneros hace aproximadamente 5 Ma (3-8 Ma 95% HPD). Sin embargo, a pesar de sus orígenes antiguos, los procesos de intradiversificación en ambos géneros fueron recuperados como más recientes.

Se obtuvieron dos clados adicionales en el nuevo género Nosferatu: clados panctostictus y steindachneri. El clado monofilético pantostictus está compuesto por una especie nominal, H. panctostictus, el cual tiene el intervalo de distribución más amplio y el número más alto de haplotipos (5) en el género. La divergencia entre los clados panctostictus y steindachneri ocurrió poco después de la separación del clado bartoni (~2 Ma, 1-3 Ma, 95% HPD).

El clado steindachneri, morfológicamente el más diverso en el nuevo género Nosferatu, está compuesto por tres especies nominales: N. pame, N. pratinus y N. steindachneri. El clado también mostró los niveles de diferenciación interna más altos entre N. pratinus y N. bartoni, N. labridens, y N. pantostictus, respectivamente.

Los verdaderos Herichthys presentaron un nivel de divergencia endogrupal inferior, comparado con el nuevo género Nosferatu; las reconstrucciones filogenéticas mostraron una resolución pobre, y ninguna especie se recuperó como monofilética. Además, discernimos que los verdaderos Herichthys son jóvenes comparados con el nuevo género Nosferatu (~1 Ma, 0.5-2 Ma, 95% HPD).

Nuevo género Nosferatu

Especie tipo. Nosferatu pame, designación original Diagnosis. Difiere de Herichthys en las siguientes medidas: cuerpo menos alto (media 41%, SD 2% vs. media 45%, SD 2%); base de aleta dorsal más corta (media 55%, SD 2% vs. media 58%, SD 2%); base de aleta anal más corta (media 22%, SD 2% vs. media 24%, SD 2%); origen de aleta dorsal a origen de aleta anal más corto (media 51%, SD 3% vs. media 55%, SD 2%); base de aleta posdorsal a origen de aleta anal más corto (media 33%, SD 3% vs. media 36%, SD 3%), entre otras. La aleta dorsal comprimida raramente se expande más allá del tercio anterior de la aleta caudal. Un ciego intestinal alargado, elástico y liso (que no se presenta en Herichthys) se adhiere al estómago saccular. El género se distingue de la mayoría de los otros géneros de Heroines por las siguientes sinapomorfías: pigmentación reproductiva: oscurecimiento del área ventral, y se extiende sobre los orificios nasales, series operculares o aletas pectorales. Todos con marcas rojas o moradas en la axila de la aleta pectoral, excepto N. bartoni. Dientes anteriores ordenados regularmente, bien espaciados, cónicos, unicúspides, pronunciadamente recurvados y puntiagudos, con implantación erecta; con transición a la prolongación en el tamaño del par de dientes con sínfisis en relación con los otros dientes en la fila exterior de la mandíbula superior, evocativo a los del vampiro Nosferatu (por tanto = dientes Nosferatuformes); y un par menos desarrollado en la mandíbula inferior. Dientes posteriores pequeños y puntiagudos, pocas o ninguna fila posterior de dientes diminutos en la mandíbula superior; los dientes en las mandíbulas son cónicos, recurvados, bien espaciados y puntiagudos; la fila frontal anterior se ordena irregularmente, recurvada y puntiaguda (frecuentemente gastados en especímenes más viejos).

Distribución geográfica. Vertiente atlántica en Veracruz, Hidalgo, Querétaro y Tamaulipas, en la cuenca del río Pánuco- Tamesí; sistema lagunar de San Andrés, incluyendo los sistemas del río Tigre y Tamiahua y sus tributarios: los ríos Cucharas y Naranjos.

Composición de especies. Nosferatu molango, N. pame, N. pratinus, N. bartoni, N. labridens, N. pantostictus, y N. steindachneri.

Herichthys Baird & Girard, 1854

Especie tipo. Herichthys cyanoguttatus Baird y Girard, 1854. Diagnosis. Difiere del nuevo género Nosferatu en que la marca roja/morada en la axila de la aleta pectoral está ausente, y la aleta dorsal comprimida se extiende más allá del tercio frontal de la aleta caudal (para la morfométrica comparativa (ver nuevo género Nosferatu en la sección previa). El género se distingue de la mayoría de otros Heroine por las siguientes sinapomorfías: seis a siete barras verticales en el flanco, con una serie de manchas oscuras abajo de la línea lateral que componen las marcas principales. Pigmentación reproductiva: oscurecimiento de la mitad posterior y las áreas anteroventrales no se extienden sobre los orificios nasales, series operculares y aletas pectorales. Dientes anteriores estrechamente espaciados, espatulados, bicúspides o ligeramente bicúspides, o una mezcla entre bicúspides y cónicos desafilados, con una curvatura derecha, con longitudes sin diferencia entre las mandíbulas superior e inferior, excepto en H. minckleyi.

Distribución geográfica. Ríos en la vertiente atlántica de México y Texas, norte de PDM, incluye: Santa Ana, Misantla, Nautla, Solteros, Tecolutla, Tenixtepec, Cazones, Pantepec, Pánuco, Soto la Marina, San Fernando, Bajo río Bravo, río Nueces en Texas y Cuatro Ciénegas; ausente en el río Conchos.

Composición de especies. H. deppii, H. tepehua n. sp., H. carpintis, H, tamasopoensis, H. cyanoguttatus, H. teporatus, y H. minckleyi.

DISCUSIÓN

El análisis molecular y morfológico apoya que el nuevo género Nosferatu es distinto del verdadero Herichthys. Los resultados coinciden con la interpretación de De la Maza3 del grupo labridens = nuevo género Nosferatu conformado con N. steindachneri (restringido al río Tamasopo), N. labridens (restringido a Media Luna y sus alrededores), N. pratinus (restringido a río el Salto, aguas arriba de las cascadas de Micos), N. pame (restringido al río Tamasopo), el polimórfico N. pantostictus que incluye un número de formas lóticas y lénticas parapátricas que habitan los tramos inferiores de la cuenca del río Pánuco-Tamesí y los sistemas de lagunas costeras de Tamiahua y San Andrés, y N. molango (restringido a Laguna Azteca). Esta última especie puede corresponder al fenómeno de contacto secundario (36) entre ambos géneros, ya que N. molango expuso afinidad de ADN mitocondrial con los verdaderos Herichthys. Además, estudios filogenéticos, particularmente el uso de ADN nuclear, son necesarios para clarificar su estado taxonómico.

Se han hecho hipótesis con base en similitudes morfológicas entre ambas especies, (37,38) que N. pame y N. steindachneri evolucionaron simpátricamente, y se infirió que éstos fueron análogos al polimórfico H. minckleyi en la cuenca de Cuatro Ciénegas. (37) Además, Artigas38 afirmó, con base en distribuciones de las dos especies, que N. pame se encuentra aguas arriba de las cascadas del río Tamasopo, mientras que N. steindachneri no, que N. pame es la especie ancestral de ambas.

Los verdaderos Herichthys incluyen ahora siete especies diagnosticables morfológicamente distintas: H. deppii (restringido a la cuenca del río Nautla-Misantla) y el alopátrico H. tepehua n. sp. (restringido a los sistemas de ríos Pantepec, Cazones, Tenixtepec, Tecolutla y Solteros); H. carpintis que incluye un número de formas lóticas y lénticas parapátricas que habitan la cuenca del río Pánuco-Tamesí, excepto en el río Tamasopo, y los sistemas de lagunas de Tamiahua y San Andrés; H. tamasopoensis (restringido al Río Tamasopo); H. teporatus restringido al río Soto la Marina; H. cyanoguttatus que incluye un número de formas alopátricas que habitan el río San Fernando, el río Bravo y los ríos adyacentes del sureste de Texas; y el polimórfico H. minckleyi (endémico al valle de Cuatro Ciénegas).

Nuestro tiempo de divergencia, estimado a través del TMVB, es de ~7 Ma (~5-11 Ma 95% HPD) para el grupo madre (Herichthys + Nosferatu) de su clado hermano, y corresponde con la formación del Macizo Chiconquiaco-Palma Sola. El Macizose localiza entre el Golfo de México y la Sierra Madre Oriental (SMO). Es parte de la Provincia Alcalina Oriental (PAOM), un cinturón volcánico que se extiende 2000 km en dirección NNO-SSE, desde el norte de Coahuila a Palma Sola, Veracruz, a lo largo de los planos costeros del GDM (39,40) e intersecta el TMVB en el Macizo Chiconquiaco-Palma Sola (6.9-3.2 Ma) en el centro de Veracruz. (39- 41)

El cambio climático en los últimos 4 millones de años incluye el fin del periodo templado (5-3 Ma) e intensificación significativa de glaciaciones en el hemisferio norte ~2.75 Ma.7 Mayores precipitaciones invernales con condiciones significativamente más frescas y húmedas que hoy, las cuales prevalecieron al norte de México durante el Pleistoceno y el Holoceno temprano. Las secuencias glaciares cuaternarias en el centro de México indicaron que hubo al menos cinco avances glaciares a finales del Pleistoceno y Holoceno temprano. (8,9) Supongamos que estos eventos devastaron las poblaciones cíclidas al norte del paralelo 24N y posiblemente más al sur, excepto por los refugios localizados en manantiales templados, como Cuatro Ciénegas. En un estudio reciente,42 se dató como 5.6 Ma el evento cladogenético que creó a H. minckleyi. Nuestro análisis de historia demográfica de los verdaderos Herichthys expuso una contracción durante el Pleisteoceno inferior que coincide con algunos de los avances glaciares en Norteamérica durante este periodo. Estos avances habrían forzado la contracción de intervalo para Herichthys (excepto H. minckleyi, el cual permaneció en las aguas templadas de Cuatro Ciénegas) a la cuenca del río Pánuco, mientras el clima se deterioraba. En tiempos más recientes, alrededor de 65,000 años atrás, algunas poblaciones de Herichthys se hubieran expandido una vez más desde el río Pánuco y reinvadido los ríos al norte.

RESUMEN

El género Herichthys, considerado como representativo monofilético de los cíclidos neotropicales al noreste de México y el sur de Texas, se distribuye sobre un área con intrincada historia geológica y climática, y afecta la diversificación temporal y espacial al norte del Eje Volcánico Transversal de México. Se realizó una reconstrucción filogenética evolutiva con un fragmento del gen mitocondrial Cox1. Se evaluó la morfología y su correspondencia con la diferenciación molecular, sugiriendo un escenario biogeográfico basado en un reloj molecular e historia demográfica. Se describió un nuevo género (Nosferatu: Nosferatu pame, N. molango, N. pratinus, N. bartoni, N. labridens, N. pantostictus y N. steindachneri), y una especie Herichthys tepehua.

Palabras clave: Nosferatu, Herichthys, Cox1, Filogenia, Filogeografía.

ABSTRACT

The genus Herichthys is considered the representative of the monophyletic Neotropical cichlids in northeastern Mexico and southern Texas. It is spread over an area characterized by an intricate geological and climatic history, which affected the temporal and spatial diversification north of the Transversal Volcanic Axis of Mexico. An evolutionary phylogenetic reconstruction was performed using a fragment of mitochondrial Cox1 gene. Morphology and their correspondence with the molecular differentiation was assessed; a biogeographical scenario based on a molecular clock and demographic history was suggested. In addition, a new genus (Nosferatu: Nosferatu pame, N. molango, N. pratinus, N. bartoni, N. labridens, N. pantostictus y N. steindachneri) and a species Herichthys tepehua were decribed.

Keywords: Nosferatu, Herichthys, Cox1, Phylogeny, Phylogeography.

* Pronatura Noreste, A.C.
** Universidad Nacional Autónoma de México.
*** Universidad Autónoma de Nuevo León.
**** Museo Nacional de Ciencias Naturales, CSIC, Madrid, España.

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Recibido: 23/09/15

Aceptado: 23/10/15

Investigación