Actualmente, el tratamiento para Hepatitis C consiste en la combinaci\u00f3n de agentes antivirales de acci\u00f3n directa, como sofosbuvir (FDA, 2013), ledipasvir, daclatasvir (USFDA, 2015), asunaprevir, paritaprevir, ombitasvir, dasabuvir, elbasvir y grazoprevir (Tamori, Enomoto y Kawada, 2016; EASL, 2015). Estos nuevos esquemas confieren una respuesta viral sostenida mayor a 95% en la mayor\u00eda de los genotipos, incluido el genotipo 1, que es el m\u00e1s prevalente en M\u00e9xico.<\/p>\n
Uno de los retos, una vez que se elimine al virus con el uso de los nuevos antivirales, es tratar la enfermedad hep\u00e1tica remanente, ya que los antivirales s\u00f3lo est\u00e1n dirigidos para bloquear la replicaci\u00f3n viral. Una terapia ideal contra la hepatitis C cr\u00f3nica involucra el tratamiento con antivirales de acci\u00f3n directa y un agente antifibr\u00f3tico, lo cual ser\u00e1 uno de los retos en los pr\u00f3ximos a\u00f1os (Arif, Levine y Sanderson, 2003).<\/p>\n
En 2011, Feld et al. <\/i>reportaron la adici\u00f3n de s-adenosil metionina (SAM) en el retratamiento de pacientes con hepatitis C no respondedores, combinado con PEG-IFN+RBV (Feld et al., <\/i>2011), encontrando que 53% de los pacientes tuvieron respuesta viral temprana y 39% presentaron RVS. Sin embargo, se desconoce el mecanismo por el cual SAM tiene este efecto en la replicaci\u00f3n del VHC. SAM se utiliza como antioxidante y para tratar hepatopat\u00edas colest\u00e1sicas, s\u00f3lo de forma reciente se ha empezado a estudiar su efecto en la replicaci\u00f3n del VHC tanto in vitro <\/i>como in vivo.<\/i><\/p>\n
Por todo lo anterior, en este trabajo se estudiaron los posibles mecanismos por los cuales SAM ejerce su efecto antiviral, con la finalidad de generar mayor conocimiento acerca de los mecanismos de patogenicidad del VHC, lo cual es de utilidad para la identificaci\u00f3n de blancos terap\u00e9uticos que pudieran potenciar el efecto de la terapia antiviral actual.<\/p>\n
METODOLOG\u00cdA<\/b><\/p>\n
Cultivo de c\u00e9lulas y tratamiento con SAM<\/b><\/p>\n
Se utiliz\u00f3 una l\u00ednea celular de hepatoma humano, Huh7- VHC replic\u00f3n, que contiene un replic\u00f3n subgen\u00f3mico del VHC genotipo 1b que expresa las prote\u00ednas no estructurales del VHC (Lohmann et al., <\/i>1999). Las c\u00e9lulas fueron cultivadas en medio ADMEM suplementado \u00a0con \u00a02% \u00a0de \u00a0SBF, \u00a01% \u00a0de \u00a0amino\u00e1cidos no esenciales, \u00a01% \u00a0de \u00a0glutamina \u00a0y \u00a01% \u00a0de \u00a0antibi\u00f3ticos (penicilina y estreptomicina). Las c\u00e9lulas se cultivaron en una atm\u00f3sfera de CO2 <\/span>de 5% a 37\u00b0C. Para los diferentes ensayos, las c\u00e9lulas se sembraron un d\u00eda antes y luego fueron tratadas con SAM 1mM de 0-72h.<\/p>\n Cuantificaci\u00f3n del RNA de VHC por qPCR<\/b><\/p>\n C\u00e9lulas Huh7 VHC-replic\u00f3n fueron sembradas y tratadas con SAM 1mM por 24-72h. El RNA total de los tiempos, 24, 48 y 72h, fue extra\u00eddo utilizando TRizol, de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Los precipitados de RNA se lavaron una vez en etanol 75% y se resuspendieron en 30 \u03bcL de agua libre de RNAsas. Se sintetiz\u00f3 el cDNA a partir del RNA obtenido. Los cDNAs fueron sometidos a qPCR para la detecci\u00f3n de VHC y de tres genes end\u00f3genos, Ribosomal\u00a018S (RPS18), actina y GAPDH, que fueron utilizados como genes normalizadores en el c\u00e1lculo de cuantificaci\u00f3n relativa por \u0394\u0394Ct. Las reacciones se llevaron a cabo con 100 ng de cDNA por triplicado, utilizando los primers y sondas espec\u00edficas para cada gen.<\/p>\n Cuantificaci\u00f3n de la expresi\u00f3n de NS5A por <\/b>western blot<\/span><\/em><\/strong><\/p>\n Se sembraron c\u00e9lulas Huh7 VHC-replic\u00f3n y se trataron como se mencion\u00f3 previamente. Se extrajo la prote\u00edna total a las 24, 48 y 72 h postratamiento, utilizando un buffer de lisis de prote\u00ednas. Se determin\u00f3 la concentraci\u00f3n de prote\u00edna total por el m\u00e9todo de Bradford. Cantidades iguales de prote\u00edna se separaron en un SDS-PAGE a 12% y fueron transferidas a membranas de PVDF. Las membranas se incubaron con uno de los anticuerpos antiNS5A y antiactina. La detecci\u00f3n se realiz\u00f3 usando el reactivo Western Blotting Chemiluminescence Luminol Reagent. Se realiz\u00f3 cada experimento por triplicado.<\/p>\n Cuantificaci\u00f3n de glutati\u00f3n total y relaci\u00f3n GSH\/GSSG<\/b><\/p>\n La detecci\u00f3n de GSH (glutati\u00f3n reducido) y GSSG (glutati\u00f3n oxidado) se realiz\u00f3 mediante el m\u00e9todo de reciclamiento de Ellman. Se ley\u00f3 la absorbancia a 405- 414 nm para obtener la estimaci\u00f3n de la concentraci\u00f3n de glutati\u00f3n en la muestra. C\u00e9lulas Huh7 VHC-replic\u00f3n fueron tratadas con SAM 1 mM, durante 1, 2, 6, 12 y 24 h. Las c\u00e9lulas se lisaron mediante ciclos de congelaci\u00f3n y descongelaci\u00f3n en PBS 1X. GSSG se midi\u00f3 mediante la derivatizaci\u00f3n de GSH con 2-vinilpiridina. El espectrofot\u00f3metro XMark TM de microplacas se utiliz\u00f3 para la medida de absorbancia usando un filtro de 415 nm.<\/p>\n Ensayo de actividad del proteasoma de tipo quimotripsina<\/b><\/p>\n El ensayo in vitro <\/i>de la actividad de quimotripsina del proteasoma 26S, consisti\u00f3 en una reacci\u00f3n de fluorescencia basada en la liberaci\u00f3n del fluor\u00f3foro 7-amido-4-metilcumarina (AMC) del p\u00e9ptido sustrato, Suc-Leu-Leu-Val-Tyr-AMC; la cual se lleva a cabo si la actividad de tipo quimotripsina est\u00e1 presente en las c\u00e9lulas. Las c\u00e9lulas Huh 7 VHC-replic\u00f3n fueron recolectadas, se extrajo y cuantific\u00f3 prote\u00edna por el m\u00e9todo del \u00e1cido bicincon\u00ednico (BCA), y se utilizaron 20 \u03bcg\u00a0de prote\u00edna para el ensayo de actividad de proteasoma adicionando 20\u03bcM del sustrato fluorog\u00e9nico comercial. El AMC liberado por la hidr\u00f3lisis fue monitoreado cada 30 min de adicionado el sustrato por 3h\/380 nm excitaci\u00f3n y 460 nm emisi\u00f3n. Se cuantific\u00f3 la actividad de quimotripsina del proteasoma a las 12-72 h de c\u00e9lulas tratadas y no tratadas con SAM; adem\u00e1s se utiliz\u00f3 MG132 (1 \u03bcM), un inhibidor del proteasoma, como control positivo de inhibici\u00f3n de la actividad del proteasoma; se realiz\u00f3 adem\u00e1s una combinaci\u00f3n de los tratamientos de SAM y MG132. Los resultados se muestran en unidades relativas de fluorescencia (RFU, del ingl\u00e9s, relative fluorescence units).<\/p>\n An\u00e1lisis estad\u00edstico y software utilizados<\/b><\/p>\n Los experimentos se realizaron al menos tres veces y cada condici\u00f3n por triplicado. Los resultados fueron evaluados por ANOVA o t <\/i>student utilizando el programa SPSS versi\u00f3n 17.0 se consider\u00f3 una diferencia significativa, cuando el valor de p fue menor a 0.05 o 0.01.<\/p>\n RESULTADOS<\/b><\/p>\n SAM disminuye la replicaci\u00f3n del VHC y la expresi\u00f3n de la prote\u00edna no estructural NS5A<\/b><\/p>\n Se realiz\u00f3 el an\u00e1lisis de la expresi\u00f3n del RNA-VHC, por medio de qPCR, para lo cual se sembraron c\u00e9lulas Huh7-VHC replic\u00f3n; al d\u00eda siguiente se inici\u00f3 el tratamiento con SAM 1mM, y enseguida se adicion\u00f3 el tratamiento de PEG-IFN (1000 UI\/ml) y RBV (50 \u03bcM), se extrajo RNA total una vez cumplido el tiempo de tratamiento, 0-72 h. Se sintetiz\u00f3 el cDNA por retrotranscripci\u00f3n y se prosigui\u00f3 con la cuantificaci\u00f3n del RNA viral por qPCR. El an\u00e1lisis se hizo por medio de cuantificaci\u00f3n relativa \u0394\u0394Ct, dando al control sin tratamiento el valor de 1. El tratamiento con PEG-IFN+RBV, utilizado como control positivo de inhibici\u00f3n de la replicaci\u00f3n del VHC, mostr\u00f3 la inhibici\u00f3n esperada a los diferentes tiempos evaluados. El nivel de RNA-VHC en presencia de SAM en monoterapia disminuy\u00f3 a un 50% a las 24h y tal efecto fue tiempo dependiente, mostrando una inhibici\u00f3n de 60% a las 72h postratamiento. En la terapia combinada se observ\u00f3 un efecto aditivo de inhibici\u00f3n de la expresi\u00f3n del RNA-VHC (figura 1).<\/p>\n Con la finalidad de determinar si el tratamiento con SAM modifica la expresi\u00f3n de las prote\u00ednas virales, se realiz\u00f3 un ensayo para extraer prote\u00ednas totales, se adicion\u00f3 el tratamiento con SAM y tratamiento con PEG-IFN+RBV, se extrajo la prote\u00edna total a las 0, 24, 48 y 72 h posteriores al inicio del tratamiento. Se cuantificaron las prote\u00ednas por el m\u00e9todo de Bradford y se procedi\u00f3 a realizar el western blot para detectar los niveles de la prote\u00edna viral NS5A usando como control de carga un anticuerpo contra \u00a0 \u00a0 \u00a0 \u03b2-actina. Se observ\u00f3 una disminuci\u00f3n de la prote\u00edna NS5A de 40-60% durante los tres tiempos evaluados, comparando con el control de c\u00e9lulas Huh7-VHC replic\u00f3n sin tratamiento (figura 2), \u00a0de \u00a0esta \u00a0manera \u00a0se \u00a0confirm\u00f3 \u00a0que \u00a0el \u00a0efecto \u00a0es \u00a0a \u00a0nivel transcripcional y traduccional. En el control positivo, PEG-IFN+RBV, se observ\u00f3 el efecto de disminuci\u00f3n esperado.<\/p>\n <\/p>\n <\/p>\n SAM estimula la bios\u00edntesis de glutati\u00f3n<\/b><\/p>\n Se evalu\u00f3 la concentraci\u00f3n de glutati\u00f3n total por el m\u00e9todo de Ellman. En presencia de SAM la s\u00edntesis de GSH se incrementa desde las 6h postratamiento. En cuanto a la relaci\u00f3n glutati\u00f3n reducido\/oxidado no se observaron cambios significativos durante los diferentes tiempos en el tratamiento (figura 3).<\/p>\n![\"\"](\"http:\/\/cienciauanl.uanl.mx\/wp-content\/uploads\/2018\/04\/figura1-1.png\")
<\/a><\/p>\n<\/a><\/p>\n