En este trabajo se describen las secuencias nucleot\u00eddicas y aminoac\u00eddicas y la probable estructura molecular de la tanasa del hongo xer\u00f3fito Aspergillus niger GH1. Adem\u00e1s, se construyeron cepas de la levadura Pichia pastoris para producir de forma extracelular la enzima, la cual se caracteriz\u00f3 bioqu\u00edmicamente y sus propiedades se compararon con las de la tanasa nativa.\u00a0 \u00a0La tanasa producida en este trabajo podr\u00eda ser utilizada en el procesado de alimentos y bebidas a bajas temperaturas.<\/p>\n
Palabras Clave:<\/strong> tanasa, Aspergillus niger GH1, mode-laje molecular, Pichia pastoris.<\/p>\n Abstract<\/strong><\/p>\n In this paper, we describe the gene and amino acid sequences, and the possible molecular structure of the tannase of the Aspergillus niger GH1. In addition, we engineered Pichia pastoris strains with a synthetic gene to produce and secrete the enzyme, Furthermore, the produced recombinant tannase was biochemically characterized, and its properties were compared to those of the native tannase from A. niger GH1. The tannase produced in this study could be used in the processing of food and beverages at low temperatures.<\/p>\n Key words:<\/strong> tannase, Aspergillus niger GH1, molecular modelling, Pichia pastoris.<\/p>\n Las tanin acil hidrolasas o tanasas (EC 3.1.1.20) son enzimas que catalizan la hidr\u00f3lisis de los enlaces \u00e9ster en galotaninos, taninos complejos y \u00e9steres de \u00e1cido g\u00e1lico, produciendo \u00e1cido g\u00e1lico como producto principal. Estas enzimas son usadas en la industria de alimentos durante la fabricaci\u00f3n del t\u00e9, clarificaci\u00f3n del vino y jugo de fruta, y para la reducci\u00f3n de efectos antinutricionales de los taninos en nutrici\u00f3n animal (Aguilar y Guti\u00e9rrez, 2001). Adem\u00e1s, el \u00e1cido g\u00e1lico se utiliza para la s\u00edntesis del antioxidante propilgalato y el antibi\u00f3tico trimetroprim. A pesar de las aplicaciones de las tanasas, el uso pr\u00e1ctico de estas enzimas es limitado debido a la falta de un procedimiento econ\u00f3mico para su producci\u00f3n a gran escala.<\/p>\n Recientemente, Aspergillus niger GH1, un hongo xer\u00f3filo, ha sido reportado como un productor de tanasa. Este microorganismo fue aislado del semidesierto mexicano y tolera condiciones extremas de la regi\u00f3n\u00a0(45-15\u00baC) (Cruz et al., 2005). La tanasa de A. niger GH1 ha demostrado ser muy efectiva para el tratamiento de desechos ricos en taninos, potenciando la actividad biol\u00f3gica de t\u00e9 y la producci\u00f3n de importantes y potentes compuestos fen\u00f3licos antioxidantes. En comparaci\u00f3n con otras tanasas, la de A. niger GH1 mostr\u00f3 alta estabilidad a pH, temperatura y otros compuestos que generalmente se encuentran en los sistemas ricos en taninos. Basados en estas propiedades, esta enzima puede ser especialmente utilizada en aplicaciones industriales.<\/p>\n Por otro lado, la levadura metilotr\u00f3fica Pichia pastoris se utiliza frecuentemente como un hospedero para la producci\u00f3n de prote\u00ednas recombinantes extracelula-res, ya que puede crecer en medios definidos simples y alcanzar altas densidades celulares, produciendo de esta manera altos niveles de prote\u00ednas extracelulares recombinantes (Sreekrishna, 2010).<\/p>\n En este trabajo se describen por primera vez las secuencias nucleot\u00eddicas y aminoac\u00eddicas, y la probable estructura molecular de la tanasa de A. niger GH1. Adem\u00e1s, se construyeron cepas de P. pastoris para producir de forma extracelular la enzima, la cual se caracteriz\u00f3 bioqu\u00edmicamente y sus propiedades se compararon con las de la tanasa nativa.<\/p>\n Materiales y M\u00e9todos<\/strong><\/p>\n Para determinar la secuencia nucleot\u00eddica de la tanasa de A. niger GH1, se sintetiz\u00f3 dicha secuencia por PCR utilizando DNA gen\u00f3mico de A. niger GH1 y oligonucle\u00f3tidos dirigidos hacia el inicio y al final de la secuencia que codifica para la prote\u00edna madura. El producto amplificado se lig\u00f3 en el vector pGEM y se transformaron c\u00e9lulas de Escherichia coli. Cinco pl\u00e1smidos prove-nientes de diferentes colonias de E. coli se secuenciaron en el Instituto de Fisiolog\u00eda Celular (UNAM), usando los oligonucle\u00f3tidos T7 y SP6. Cuatro de estos pl\u00e1smidos se secuenciaron nuevamente empleando oligonucle\u00f3tidos internos dise\u00f1ados con base en la secuencia nucleot\u00eddica obtenida con los oligonucle\u00f3tidos T7 y SP6. Se determin\u00f3 la secuencia nucleot\u00eddica consenso a partir de las 18 secuencias nucleot\u00eddicas, empleando el m\u00f3dulo CAP (Contig Assembly Program) del programa BioEdit v7.0.8.0. Esta secuencia y la secuencia aminoac\u00eddica deducida se compararon con las secuencias reportadas en la base de datos GenBank mediante las herramientas BLAST del NCBI y se determinaron los porcentajes de identidad con otras tanasas f\u00fagicas mediante el programa Clustal Omega. Se hizo un an\u00e1lisis de dominios funcionales de la tanasa de A. niger GH1 por comparaci\u00f3n de la secuencia aminoac\u00eddica obtenida con la base de datos de familias de prote\u00ednas Pfam. Se construy\u00f3 un modelo molecular de la prote\u00edna con el servidor Phyre (2), y con el programa Swiss-PdbViewer\/DeepView 4.1 se analizaron aspectos estructurales y funcionales de la tanasa de A. niger GH1. Con el ser-vidor NetNGlyc 1.0 se predijeron los posibles sitios de N-glicosilaci\u00f3n.<\/p>\n Para la construcci\u00f3n de cepas recombinantes de P. pastoris KM71 productoras de la tanasa de A. niger GH1, se dise\u00f1\u00f3 un gen artificial (ANTgs) que codifica para la tanasa de A. niger GH1 mediante el uso de co-dones preferenciales de P. pastoris y la inclusi\u00f3n de la secuencia prepro del factor alfa de Sacharomyces cerevisiae. El gen artificial fue sintetizado, clonado en el vector pUC57 y subclonado en pPIC9 para obtener el pl\u00e1smido pPIC9ANTgs. Se lineariz\u00f3 el pl\u00e1smido pPI-C9ANTgs construido con la enzima SalI y se transform\u00f3 la cepa KM71 de P. pastoris mediante electropo-raci\u00f3n. De las cepas construidas se caracterizaron su genotipo (aox1 y ANT+<\/sup>) mediante PCR y su fenotipo mediante la evaluaci\u00f3n de la expresi\u00f3n de la secuencia clonada en cultivos a nivel matraz, a trav\u00e9s de la actividad enzim\u00e1tica extracelular de tanasa.<\/p>\n Con el fin de realizar una caracterizaci\u00f3n bioqu\u00edmica de la enzima producida, con una preparaci\u00f3n enzim\u00e1tica obtenida por ultrafiltraci\u00f3n del medio de cultivo libre de c\u00e9lulas de los cultivos en matraz, se determin\u00f3 la presencia de posibles N-glicosilaciones evaluando el cambio en la migraci\u00f3n en geles de poliacrilamida de muestras tratadas y sin tratar con la glucosidasa endo Hf<\/sub>. Adem\u00e1s, se determin\u00f3 la presencia de una posible estructura bicatenaria de la tanasa producida. Se evalu\u00f3 el efecto del pH y la temperatura en la actividad enzim\u00e1tica de tanasa, la estabilidad de la enzima a cuatro y 30\u00b0C, la actividad espec\u00edfica y los par\u00e1metros cin\u00e9ticos Km<\/sub> y Vmax<\/sub>.<\/p>\n Resultados<\/strong><\/p>\n Determinaci\u00f3n de la secuencia nucleot\u00eddica y aminoac\u00eddica de la tanasa nativa de A. niger GH1<\/strong><\/p>\n La secuencia nucleot\u00eddica de la tanasa de A. niger GH1 madura tuvo una longitud 1,686 pb, sin intrones, y codifica para una prote\u00edna de 562 amino\u00e1cidos. Esta secuencia nucleot\u00eddica se registr\u00f3 en la base de datos GenBank con la clave de acceso KP273835.<\/p>\n La secuencia de amino\u00e1cidos de la tanasa de A. niger GH1 mostr\u00f3 identidades de 78.6-99.4% con respecto a las seis tanasas f\u00fangicas m\u00e1s similares: Aspergillus kawachii IFO 4308 (GenBank GAA91900.1, 99.4%), A. niger CBS 513.88 (GenBank XP_001402486.1, 98.0%), A. niger ATCC 1015 (GenBank EHA22262.1, 97.1%), Aspergillus terreus NIH2624 (GenBank XP_001216558.1, 80.0%), A. niger (GenBank ABX89592.1, 79.2%) y la tanasa y feruloil esterasa de Aspergillus ruber CBS 135680 (GenBank EYE96818.1, 78.6%); con identidades en las secuencia nucleot\u00eddicas que van en un intervalo de 73.3 a 98.6% para las mismas tanasas f\u00fangicas. El an\u00e1lisis con Pfam mostr\u00f3 que la secuencia de la tanasa de A. niger GH1 tiene un dominio del residuo 53 al 545 que pertenece a la familia Tanasa PF07519 en donde se agrupan otras tanasas, feruloil estearasas y varias prote\u00ednas de bacterias de funci\u00f3n desconocida. Esta familia es un miembro del clan AB_hidrolasa (CL0028) cuyo dominio catal\u00edtico se encuentra en una amplia gama de enzimas, ya que este clan contiene 67 miembros. En la familia PF07519 se\u00a0encuentran descritas 15 arquitecturas de organizaci\u00f3n de dominios, presentando la tanasa de A. niger GH1 la arquitectura m\u00e1s sencilla de un \u00fanico dominio.<\/p>\n El programa Phyre2<\/sup>\u00a0realiz\u00f3 un modelo molecular con todos los amino\u00e1cidos de la tanasa de A. niger GH1, 512 residuos (91%) fueron modelados con base en la estructura 3WMT, que pertenece a una feruloil esterasa (Suzuki et al., 2014), y 50 residuos (9%) fue-ron modelados mediante t\u00e9cnicas de ab initio. El modelo molecular de la tanasa de A. niger GH1 (figura 1A) mostr\u00f3 la presencia de 16 h\u00e9lices alfa y 16 hojas beta que abarcan 29 y 13% de la prote\u00edna, respectiva-mente; que forman dos dominios estructurales, uno de ellos con un plegamiento tipo \u03b1\/\u03b2-hidrolasa que constituye el dominio catal\u00edtico, y el otro un dominio tipo tapa que cubre el sitio catal\u00edtico. A partir del modelo molecular y mediante comparaci\u00f3n con la estructura 3WMT, se proponen los residuos Ser-196, Asp-448, e His-494 como los que constituyen la triada catal\u00edtica. Adem\u00e1s, estos residuos de serina e histidina pudieran estar directamente conectados mediante un puente di-sulfuro entre las ciste\u00ednas que se encuentran contiguas a la serina e histidina, Cys-195 y Cys-495 (figura 1B), formando el motivo estructural descrito recientemente (CS-D-HC) (Suzuki et al., 2014). El modelo molecular tambi\u00e9n mostr\u00f3 que uno de los sitios de reconocimiento tipo Kex2 (Lys-309-Arg-310, figura 1C) se encuentra en un loop flexible del dominio de tapa.<\/p>\n Construcci\u00f3n de cepas recombinantes de P. pastoris portadoras del fragmento ANTgs (KM71ANT)<\/strong><\/p>\n La secuenciaci\u00f3n del DNA del pl\u00e1smido pUC57 confirm\u00f3 la secuencia nucleot\u00eddica correcta del gen sint\u00e9tico ANTgs. El gen sint\u00e9tico de la tanasa junto con la secuencia nucleot\u00eddica que codifica para la p\u00e9ptido prepro del factor alfa de S. cerevisiae tuvo un tama\u00f1o de 1,961 pb. El an\u00e1lisis mediante PCR del pl\u00e1smido recombinante, usando los oligonucle\u00f3tidos de AOX, mostr\u00f3 un producto de 2,158 pb que confirm\u00f3 la construcci\u00f3n del pl\u00e1smido pPIC9ANTgs. La transformaci\u00f3n de c\u00e9lulas de P. pastoris KM71 con el pl\u00e1smido pPIC9ANTgs previamente digerido con SalI gener\u00f3 15 colonias transformadas His+<\/sup>. El an\u00e1lisis mediante PCR con los oligonucle\u00f3tidos de AOX mostr\u00f3 una banda de 2,158 pb que corresponde a la secuencia que codifica para la secuencia prepro del factor alfa (255 pb), a la secuencia del gen sint\u00e9tico que codifica para la tanasa de A. niger GH1 (1,689 pb) y los fragmentos del sitio m\u00faltiple de clonaci\u00f3n del vector pPIC9 (21 pb), promotor de AOX1 (94 pb) y del terminador de la transcripci\u00f3n (99 pb).<\/p>\n Producci\u00f3n y caracterizaci\u00f3n bioqu\u00edmica de la tanasa de A. niger GH1 recombinante<\/strong><\/p>\n Despu\u00e9s de 48 h de cultivo de una cepa KM71ANT en condiciones de inducci\u00f3n del gen heter\u00f3logo, el medio de cultivo libre de c\u00e9lulas mostr\u00f3 una actividad volum\u00e9trica de tanasa de 0.57 U\/ml y una concentraci\u00f3n de prote\u00ednas de 46.71 mg\/L. Estos resultados corroboraron la capacidad de la cepa KM71ANT de producir y secretar al medio de cultivo la tanasa de A. niger GH1 recombinante, y por lo tanto confirmaron su fenotipo ANT+<\/sup>. Con el proceso de ultrafiltraci\u00f3n que se aplic\u00f3 al medio de cultivo libre de c\u00e9lulas se obtuvo un concentrado de tanasa (25.7 U\/ml) que se emple\u00f3 para la caracterizaci\u00f3n bioqu\u00edmica de la tanasa recombinante producida.<\/p>\n En el an\u00e1lisis de SDS-PAGE (figura 2), la tanasa recombinante sin tratamiento con la enzima endo Hf<\/sub> mostr\u00f3 dos bandas anchas de masas moleculares aparentes de 45.0-54.8 y 41.8-45.0 kDa, con una intensidad mayor en las masas moleculares de 48.7 y 42.4 kDa (figura 2, carril 2). Despu\u00e9s de la N-desglicosilaci\u00f3n con endo Hf<\/sub>, las dos bandas se movieron a posiciones con masas moleculares aparentes de 34.6 y 30.3 kDa, respectiva-mente (figura 2, carril 3).<\/p>\n Estos resultados indican claramente que la tanasa est\u00e1 altamente N-glicosilada y que posee dos cadenas polipept\u00eddicas. Adem\u00e1s, el an\u00e1lisis de la secuencia aminoac\u00eddica de la tanasa recombinante con el programa NetNGlyc 1.0 mostr\u00f3 que la tanasa madura de A. niger GH1 tiene 11 sitios potenciales de N-glicosilaci\u00f3n: 19NGTL, 54NVTV, 130NGSI, 237NATI, 265NLTS, 280NYTS, 304NGSV, 383NVTY, 451NTTY, 508NATV y 535NSSF.<\/p>\n La tanasa recombinante producida tuvo un pH \u00f3ptimo de 5.0 (figura 3A) y mostr\u00f3 m\u00e1s de 80% de su m\u00e1xima actividad en el intervalo de pH entre 4.0 y 5.0. Adem\u00e1s, mostr\u00f3 actividad en un amplio intervalo de temperaturas (10-50\u00b0C) con m\u00e1s de 40% de su m\u00e1xima actividad y una temperatura \u00f3ptima de 20\u00b0C (figura 3B). La actividad residual (figura 3C) en los ensayos de estabilidad siguieron cin\u00e9ticas de orden cero con una velocidad de reacci\u00f3n de 0.01 y 0.48%\/h a 4 y 30\u00baC, respectivamente, disminuyendo a 98.9 y 44.0% despu\u00e9s de 120 h.<\/p>\n Un cromatograma de intercambio ani\u00f3nico del con-centrado de la tanasa recombinante mostr\u00f3 dos picos predominantes mediante detecci\u00f3n por UV a 280 nm. La actividad espec\u00edfica (20\u00baC, pH 5.0) en el m\u00e1ximo de uno de estos picos fue de 50 U\/mg de prote\u00edna. La actividad de la tanasa recombinante sigui\u00f3 una cin\u00e9tica t\u00edpica de Michaelis-Menten a 20 y 30\u00b0C (r2= 0.947 y 0.978, respectivamente). Las constantes de Michaelis (Km<\/sub>) y la velocidad m\u00e1xima de reacci\u00f3n (Vmax<\/sub>) fueron estimadas en valores de 1.98 \u00b1 0.50 mM y 2.01 \u00b1 0.14 \u00b5mol\/min, y 0.18 \u00b1 0.04 mM y 0.48 \u00b1 0.02 \u00b5mol\/min a 20 y 30\u00b0C, respectivamente.<\/p>\n Discusi\u00f3n<\/strong><\/p>\n Recientemente, el hongo xer\u00f3filo A. niger GH1 ha sido descrito como un productor de tanasa (Cruz et al., 2005). Las propiedades bioqu\u00edmicas de la tanasa nativa de A. niger GH1 tambi\u00e9n han sido descritas (Renovato et al., 2011). En el presente trabajo se reportan las secuencias nucleot\u00eddica y aminoac\u00eddica de la tanasa madura de A. niger GH1. Adem\u00e1s, se utiliz\u00f3 el siste-ma de expresi\u00f3n de P. pastoris para producir la enzima, utilizando un gen sint\u00e9tico, y se caracteriz\u00f3 la tanasa recombinante producida.<\/p>\n Las secuencias nucleot\u00eddica y aminoac\u00eddica de la ta-nasa de A. niger GH1 resultaron ser similares, pero no id\u00e9nticas, a la tanasa de A. kawachii IFO 4308. Debido a que no hay una estructura tridimensional reportada de una prote\u00edna con una alta identidad en su secuencia con la tanasa de A. niger GH1 que se encuentre disponible en el Protein Data Bank, fue necesario emplear el m\u00e9todo threading para modelar la estructura tridimensional de la tanasa de A. niger GH1 a trav\u00e9s del servidor Phyre2<\/sup>, uno de los mejores servidores seg\u00fan el \u201cCritical Assessment of Protein Structure Prediction\u201d (CASP) (Kelley y Sternberg, 2009). Con el modelo molecular se encontr\u00f3 que la tanasa tiene un plegamiento similar a la estructura tridimensional de una feruloilesterasa de A. oryzae cuyo c\u00f3digo PDB es 3WMT (dos dominios estructurales: un dominio \u03b1\/\u03b2-hidrolasa y un dominio de tapa), la cual tiene una identidad en la secuencia aminoac\u00eddica de 24% respecto a la tanasa de A. niger GH1. Adicionalmente, ambas estructuras tienen una triada catal\u00edtica que forma el dominio estructural CS-D-HC.<\/p>\n El presente trabajo es el primer reporte de una estructura molecular propuesta de una tanasa de la familia de las Tanasas PF07519 con un plegamiento muy similar a una feruloilesterasa, que tiene dos dominios estructurales y el motivo CS-D-HC. Sin embargo, la especificidad de las dos enzimas hacia su substrato es diferente, probablemente porque el sitio de uni\u00f3n al sustrato est\u00e1 formado por diferentes residuos de amino\u00e1cidos en las dos enzimas: Phe-225, Gln-228, Gln-229, Glu-365, Ser-279, Gly-381, e Ile-451 para la tanasa de A. niger GH1, y Phe-232, Leu-235, Thr-236, Tyr-348, Phe-354, Tyr-356, e Ile-419 para la feruloilesterasa de A. oryzae (Suzuki et al., 2014).<\/p>\n Actualmente ha sido reportada la producci\u00f3n de siete tanasas en microorganismos, Lactobacillus plan-tarum, Klebsiella pneumoniae, Bacillus licheniformis, Aspergillus awamori, Aspergillus oryzae y A. niger. Entre estas tanasas, seis fueron nativas y s\u00f3lo una de A. oryzae fue producida como recombinante (Yu y Li, 2008; Zhong et al., 2004). De entre las tanasas nativas, cinco han sido producidas en cultivo sumergido convencional y s\u00f3lo la de A. niger GH1 fue producida de manera extracelular en cultivo en estado s\u00f3lido, siendo el nivel de producci\u00f3n m\u00e1s alto (2,291 U\/L en 20 h) comparada a las otras tanasas nativas. Sin embargo, en el caso de la tanasa de A. niger GH1, se observ\u00f3 una disminuci\u00f3n en la actividad despu\u00e9s de 20 h de incubaci\u00f3n, la cual estuvo asociada con un concomitante incremento de actividad de proteasas (Cruz et al., 2005).<\/p>\n La tanasa de A. oryzae ha sido producida en el sis-tema de expresi\u00f3n de P. pastoris de manera extracelular (Zhong et al., 2004) e intracelular (Yu y Li, 2008), resultando una actividad de 7 U\/ml despu\u00e9s de 96 h de inducci\u00f3n en un cultivo en lote alimentado empleando un biorreactor de 3 L en el primer caso, y 0.96 U\/ml despu\u00e9s de 72 h de inducci\u00f3n en un cultivo a nivel matraz para el segundo caso, ambos realizados con una cepa Muts. Sin embargo, en ning\u00fan caso se usaron genes sint\u00e9ticos basados en el uso de codones preferenciales de P. pastoris y optimizado el contenido de AT para el gen de la tanasa o la secuencia codificante del p\u00e9ptido prepro del factor alfa de S. cerevisiae, ni se describieron las propiedades bioqu\u00edmicas de las tanasas recombinantes, excepto por la formaci\u00f3n de una estructura de doble cadena. Debido a que altas densidades celulares en P. pastoris pueden ser alcanzadas en un simple biorreactor en una forma controlada, se puede esperar un incremento de 10 a 100 veces en la producci\u00f3n de la tanasa de A. niger GH1 producida a nivel matraz, tal como se ha descrito para otras prote\u00ednas producidas en P. pastoris (Viader et al., 2013).<\/p>\n El servidor NetNGlyC 1.0 calcul\u00f3 once sitios potenciales de N-glicosilaci\u00f3n para la tanasa de A. niger GH1. De entre estos sitios potenciales de N-glicosilaci\u00f3n, tres (130NGSI, 265NLTS y 451NTTY) son m\u00e1s probables a ser N-glicosilados, ya que el modelo mo-lecular de la tanasa de A. niger GH1 mostr\u00f3 que estos tres sitios est\u00e1n en la superficie de la prote\u00edna. Adem\u00e1s, los resultados del tratamiento con la glicosidasa endo Hf<\/sub> claramente demuestran que la tanasa recombinante fue N-glicosilada, ya que no se observ\u00f3 una banda en los geles de SDS-PAGE correspondiente la masa molecular te\u00f3rica de la tanasa madura de A. niger GH1 (61.4 kDa), con base en la secuencia aminoac\u00eddica deducida a partir del gen de la tanasa. Sin embargo, se observaron principalmente dos bandas anchas (figura 2, carril 2) en masas moleculares menores (48.7 y 42.4 kDa) que la masa molecular te\u00f3rica esperada para la tanasa madura de A. niger GH1, que se movieron a dos bandas definidas a masas moleculares de 34.6 y 30.3 kDa (figura 2, carril 3) despu\u00e9s de la N-desglicosilaci\u00f3n mediante la glicosidasa endo Hf<\/sub>. Estos resultados tambi\u00e9n indi-can que el concentrado enzim\u00e1tico de tanasa recombinante tuvo un alto grado de pureza. Adem\u00e1s, la tanasa recombinante consisti\u00f3 de dos subunidades, probable-mente unidas mediante un puente disulfuro, generadas por un corte con la proteasa Kex2 del producto del gen de tanasa, ya que la secuencia de la tanasa madura de A. niger GH1 tiene dos pares de amino\u00e1cidos b\u00e1sicos (Lys-309-Arg-310, y Lys-347-Arg-348) que son un sitio t\u00edpico de reconocimiento de la proteasa Kex2. Este tipo de estructura ha sido descrita para la tanasa nativa de A. oryzae (Hatamoto et al., 1996), y una tanasa de A. oryzae recombinante ya sea producida de forma extracelular (Zhong et al., 2004) o intracelular (Yu y Li, 2008, en P. pastoris. De los dos sitios de reconocimien-to Kex2, el sitio Lys-309-Arg-310 es m\u00e1s probable que sea reconocido por la proteasa Kex2, ya que el modelo molecular mostr\u00f3 que este sitio se encuentra en la superficie de la prote\u00edna en un loop flexible del dominio de tapa (figura 1C). Un corte por la proteasa Kex2 a un lado de Arg-310 generar\u00eda dos p\u00e9ptidos de 31.2 y 30.2 kDa. El puente disulfuro entre la Cys-195 y la Cys-495 unir\u00eda ambos p\u00e9ptidos.<\/p>\n Las tanasas de A. niger GH1 nativa y recombinante tienen la misma secuencia de amino\u00e1cidos. Por lo tanto, cualquier diferencia en sus propiedades bioqu\u00edmicas (efecto del pH y temperatura en la actividad enzim\u00e1tica, y estabilidad) podr\u00eda ser debido a sus diferentes grados de N-glicosilaci\u00f3n o a sus diferentes estructuras, ya que la tanasa nativa de A. niger GH1 es principalmente una cadena glicopolipept\u00eddica simple de 102-105 kDa (Renovato et al., 2011) y la tanasa recombinante es una\u00a0prote\u00edna de doble cadena hiperglicosilada. La N-glico-silaci\u00f3n afecta las propiedades bioqu\u00edmicas como la masa molecular y el pH \u00f3ptimo. Mientras que la tanasa nativa de A. niger GH1 mostr\u00f3 un pH \u00f3ptimo de 6.0-7.0 y una temperatura \u00f3ptima de 60\u00baC (Renovato et al., 2011), la tanasa de A. niger GH1 recombinante mostr\u00f3 un pH \u00f3ptimo de 5.0 y una temperatura \u00f3ptima de 20\u00baC. La tanasa recombinante producida en el presente traba-jo es la primera descrita del g\u00e9nero Aspergillus con una temperatura \u00f3ptima de 20\u00baC. Adem\u00e1s, la tanasa de A. niger GH1 recombinante tuvo mayor actividad relativa en comparaci\u00f3n con la nativa de A. niger GH1 en un intervalo de temperaturas de 10 a 40\u00baC, lo cual podr\u00eda ser una ventaja para muchas aplicaciones en alimentos y bebidas (Ch\u00e1vez et al., 2012). Las tanasas nativa y recombinante mostraron alta actividad residual a 4\u00baC por al menos 120 h. Es de remarcar que las propiedades bioqu\u00edmicas de una tanasa de Aspergillus con estructura de doble cadena no han sido descritas hasta hace poco (Mizuno, Shiono y Koseki, 2014). Sin embargo, en ese trabajo las propiedades bioqu\u00edmicas de la tanasa nativa y recombinante fueron muy similares, probablemente porque ambas tuvieron una estructura de doble cadena, lo cual no es nuestro caso.<\/p>\n Basados en sus perfiles de actividad a diferentes valores de pH y temperatura, la tanasa producida podr\u00eda ser utilizada en el procesado de alimentos y bebidas a bajas temperaturas.<\/p>\n Agradecimientos<\/strong><\/p>\n Agradecemos al grupo de trabajo del Dr. Crist\u00f3bal No\u00e9 Aguilar Gonz\u00e1lez (Laboratorio de Alimentos, Facultad de Ciencias Qu\u00edmicas, Universidad Aut\u00f3noma de Coahuila, Saltillo, M\u00e9xico) por proporcionar el DNA gen\u00f3mico de A. niger GH1 y por sugerencias t\u00e9cnicas, as\u00ed como a la Dra. Fabiola Veana por el apoyo t\u00e9cnico. J.A.F.G. agradece al Conacyt por la beca otorgada.<\/p>\n *Universidad Aut\u00f3noma de Nuevo Le\u00f3n.<\/p>\n Contacto: jose.viadersl@uanl.edu.mx<\/p>\n <\/p>\n Referencias<\/p>\n Aguilar, C.N., Guti\u00e9rrez S., G. (2001). Review: sources, properties, applications and potential uses of tannin acyl hydrolase. Food Sci Technol Int 7, 373-382.<\/p>\n Ch\u00e1vez G., M., et al. (2012). Biotechnological advances and challenges of tannase: an overview. Food Bioprocess Technol. 5, 445-459.<\/p>\n Cruz H., M., et al. (2005). Isolation and evaluation of tannin-degrading fungal strains from the Mexican desert. Z. Naturforsch. C 60, 844-848.<\/p>\n Hatamoto, O., et al. (1996). Cloning and sequencing of the gene encoding tannase and a structural study of the tannase subunit from Aspergillus oryzae. Gene, 175, 215-221.<\/p>\n Kelley, L.A., Sternberg, M.J. (2009). Protein structure prediction on the Web: a case study using the Phyre server. Nat. Protoc. 4, 363-371.<\/p>\n Mizuno, T., Shiono, Y., Koseki, T. (2014). Biochemical characterization of Aspergillus oryzae native tanna-se and the recombinant enzyme expressed in Pichia pastoris. J. Biosci. Bioeng. 118, 392-395.<\/p>\n Renovato, J., et al. (2011). Differential properties of Aspergillus niger tannase produced under solid-state and submerged fermentations. Appl. Biochem. Bio-technol. 165, 382-395.<\/p>\n Sreekrishna, K. (2010). Pichia, optimization of protein expression. In: Flickinger M. C., editor. Encyclope-dia of industrial biotechnology: bioprocess, bioseparation, and cell technology. Hoboken: Wiley, pp. 1-16<\/p>\n Suzuki, K., et al. (2014). Crystal structure of a feruloyl esterase belonging to the tannase family: A disulfide bond near a catalytic triad. Proteins 82, 2857-2867.<\/p>\n Viader S., J.M., et al. (2013). Optimization of \u00bfve environmental factors to increase beta-propeller phytase production in Pichia pastoris and impact on the physiological response of the host. Biotechnol. Prog. 29, 1377-1385.<\/p>\n Yu, X.W., Li, Y.Q. (2008). Expression of Aspergillus oryzae tannase in Pichia pastoris and its application in the synthesis of propyl gallate in organic solvent. Food Technol. Biotechnol. 46, 80-85.<\/p>\n Zhong, X., et al. (2004). Secretion, purification, and characterization of a recombinant Aspergillus oryzae tannase in Pichia pastoris. Protein Expr. Purif. 36, 165-169.<\/p>\n RECIBIDO: 18-08-2016<\/p>\n ACEPTADO: 05-09-2016<\/p>\n <\/p>\n <\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":" Jos\u00e9 Antonio Fuentes Garibay*, Martha Guerrero Olazar\u00e1n*, Jos\u00e9 Mar\u00eda Viader Salvad\u00f3* CIENCIA UANL \/ A\u00d1O 20, No. 83, ENERO-MARZO 2017 Resumen En este trabajo se describen las secuencias nucleot\u00eddicas y aminoac\u00eddicas y la probable estructura molecular de la tanasa del hongo xer\u00f3fito Aspergillus niger GH1. Adem\u00e1s, se construyeron cepas de la levadura Pichia pastoris para producir de forma extracelular la […]<\/p>\n","protected":false},"author":2,"featured_media":6930,"comment_status":"closed","ping_status":"closed","sticky":false,"template":"","format":"standard","meta":{"_monsterinsights_skip_tracking":false,"_monsterinsights_sitenote_active":false,"_monsterinsights_sitenote_note":"","_monsterinsights_sitenote_category":0,"footnotes":""},"categories":[27],"tags":[],"class_list":["post-6928","post","type-post","status-publish","format-standard","has-post-thumbnail","hentry","category-investigacion"],"_links":{"self":[{"href":"https:\/\/cienciauanl.uanl.mx\/index.php?rest_route=\/wp\/v2\/posts\/6928","targetHints":{"allow":["GET"]}}],"collection":[{"href":"https:\/\/cienciauanl.uanl.mx\/index.php?rest_route=\/wp\/v2\/posts"}],"about":[{"href":"https:\/\/cienciauanl.uanl.mx\/index.php?rest_route=\/wp\/v2\/types\/post"}],"author":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/cienciauanl.uanl.mx\/index.php?rest_route=\/wp\/v2\/users\/2"}],"replies":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/cienciauanl.uanl.mx\/index.php?rest_route=%2Fwp%2Fv2%2Fcomments&post=6928"}],"version-history":[{"count":2,"href":"https:\/\/cienciauanl.uanl.mx\/index.php?rest_route=\/wp\/v2\/posts\/6928\/revisions"}],"predecessor-version":[{"id":6933,"href":"https:\/\/cienciauanl.uanl.mx\/index.php?rest_route=\/wp\/v2\/posts\/6928\/revisions\/6933"}],"wp:featuredmedia":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/cienciauanl.uanl.mx\/index.php?rest_route=\/wp\/v2\/media\/6930"}],"wp:attachment":[{"href":"https:\/\/cienciauanl.uanl.mx\/index.php?rest_route=%2Fwp%2Fv2%2Fmedia&parent=6928"}],"wp:term":[{"taxonomy":"category","embeddable":true,"href":"https:\/\/cienciauanl.uanl.mx\/index.php?rest_route=%2Fwp%2Fv2%2Fcategories&post=6928"},{"taxonomy":"post_tag","embeddable":true,"href":"https:\/\/cienciauanl.uanl.mx\/index.php?rest_route=%2Fwp%2Fv2%2Ftags&post=6928"}],"curies":[{"name":"wp","href":"https:\/\/api.w.org\/{rel}","templated":true}]}}![\"\"](\"http:\/\/cienciauanl.uanl.mx\/wp-content\/uploads\/2017\/10\/fig_1_modelo_molecular.png\")
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