{"id":5170,"date":"2016-01-01T21:22:24","date_gmt":"2016-01-02T03:22:24","guid":{"rendered":"http:\/\/cienciauanl.uanl.mx\/?p=5170"},"modified":"2016-01-20T11:06:46","modified_gmt":"2016-01-20T17:06:46","slug":"oxido-nitrico-sintasa-inos-mediador-antiviral-frente-al-vhc","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/cienciauanl.uanl.mx\/?p=5170","title":{"rendered":"O\u0301xido ni\u0301trico sintasa (iNOS), mediador antiviral frente al VHC"},"content":{"rendered":"
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\"Nitric_Oxide_Synthase\"<\/a><\/p>\n

CLARA PATRICIA RI\u0301OS IBARRA*, SONIA LOZANO SEPU\u0301LVEDA*, LINDA MUN\u0303OZ ESPINOSA*, ANA ROSA RINCO\u0301N SA\u0301NCHEZ*, ANA MARI\u0301A RIVAS ESTILLA*<\/p>\n

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CIENCIA UANL \/ AN\u0303O 18, No. 76, NOVIEMBRE-DICIEMBRE 2015<\/p>\n

Art\u00edculo en PDF<\/a><\/p>\n<\/div>\n<\/div>\n<\/div>\n

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El virus de la hepatitis C (VHC) infecta aproximadamente a 3% de la poblacio\u0301n mundial y es un agente etiolo\u0301gico importante de la hepatitis cro\u0301nica, cirrosis hepa\u0301tica y ca\u0301ncer de hi\u0301gado. (1) El VHC, un virus de la familia Flaviviridae, posee un genoma de ARN, de cadena positiva de aproximadamente 9.6 kb. (2,3) Los pacientes con hepatitis C cro\u0301nica se tratan actualmente con IFN-a pegilado (PEG-IFN) en combinacio\u0301n con ribavirina; sin embargo, todavi\u0301a no existe cura para una gran proporcio\u0301n de los pacientes con hepatitis C cro\u0301nica; (4,5) por consiguiente, el desarrollo de nuevas terapias para la infeccio\u0301n por VHC es crucial para mejorar el tratamiento. (6)<\/p>\n

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Los mecanismos por los que el VHC provoca dan\u0303o celular son poco conocidos, y los diferentes mecanismos descritos sugieren un importante papel del estre\u0301s oxidativo y nitrosativo, con la infeccio\u0301n cro\u0301nica del virus. (7,8)<\/p>\n

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Aunque la importancia de estas especies reactivas de nitro\u0301geno y oxi\u0301geno se ha documentado como una defensa natural contra las bacterias y los hongos, su papel en la patoge\u0301nesis de las infecciones virales se entiende so\u0301lo parcialmente. (9,10) Se ha informado que el o\u0301xido ni\u0301trico (NO) tiene consecuencias perjudiciales en la presencia de especies reactivas de oxi\u0301geno, ya que se forman peroxinitritos.<\/p>\n

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Se ha reportado la activacio\u0301n de iNOS a trave\u0301s de las protei\u0301nas de VHC implicadas en la replicacio\u0301n; (11) sin embargo, el mecanismo sigue siendo poco definido. Cada vez hay mayor evidencia de la participacio\u0301n de o\u0301xido ni\u0301trico (NO) como uno de los mediadores ma\u0301s versa\u0301tiles en el control de diversos virus. (12-14)<\/p>\n

Hemos informado anteriormente que el a\u0301cido acetilsalici\u0301lico (AAS, aspirina), un fa\u0301rmaco antiinflamatorio no esteroideo, disminuye los niveles de protei\u0301na virales de VHC. (15) Adema\u0301s, se encontro\u0301 que la actividad antiviral de AAS se media, al menos en parte, por sus propiedades antioxidantes y capacidad para regular la COX-2 y la expresio\u0301n de SOD. (16) Sin embargo, los mecanismos au\u0301n no se han dilucidado. En este trabajo se investigo\u0301 si la expresio\u0301n de iNOS tiene un papel en la regulacio\u0301n inhibitoria de la expresio\u0301n del VHC mediada por AAS. Nuestros hallazgos sugieren que el AAS reduce la expresio\u0301n de iNOS, a trave\u0301s de la regulacio\u0301n negativa de su promotor ge\u0301nico y comprobacio\u0301n mediante un estudio de silenciamiento ge\u0301nico.<\/p>\n

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MATERIAL Y ME\u0301TODOS<\/strong><\/p>\n

Cultivo celular y tratamiento con AAS<\/strong><\/p>\n

Se utilizo\u0301 un sistema de cultivo celular Huh7 replico\u0301n subgeno\u0301mico genotipo 1b del VHC (que alberga el replico\u0301n subgeno\u0301mico de VHC I389\/ NS3-3′).15 Previo al tratamiento, las ce\u0301lulas se sembraron 12 horas antes, y luego se expusieron a 4 mM de AAS durante 24, 48 y 72 horas. Los ensayos de viabilidad demostraron que no hay efectos citoto\u0301xicos del AAS en las concentraciones utilizadas.15 Posteriormente, se llevo\u0301 a cabo la extraccio\u0301n del RNA y protei\u0301na total para realizar los ensayos de PCR en tiempo real (RT-qPCR) y western blot. AAS se adquirio\u0301 de Sigma (St. Louis MO) con pureza qui\u0301mica ~99%.<\/p>\n

Western blot<\/strong><\/p>\n

Las protei\u0301nas aisladas de los cultivos celulares se cuantificaron como se describe en Rivas-Estilla et al.,20 50 ug de protei\u0301nas se separaron en 10% SDS-PAGE y fueron transferidas a membranas de PVDF (Amersham Biosciences, Freiburg, Alemania), las cuales se incubaron con uno de los siguientes anticuerpos: anticuerpo monoclonal de rato\u0301n anti-iNOS (1: 200) (Thermo Scientific, Rockford, EE.UU.); anticuerpo policlonal anti-nitrotirosina (1: 200) (Santa Cruz, California, EE.UU.); o antiactina MAb (dilucio\u0301n 1: 5000; MP Biomedicals, Aurora, Ohio, EE.UU.). La deteccio\u0301n se realizo\u0301 mediante un sistema de quimioluminiscencia (Amersham Biosciences, Freiburg, Alemania).<\/p>\n

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Extraccio\u0301n de RNA<\/strong><\/p>\n

El RNA total se aislo\u0301 con Trizol (Life Technologies Corporation, Carlsbad, CA), de acuerdo con las especificaciones del fabricante. El RNA se precipito\u0301 con isopropaniol y lavado una vez con etanol a 70% ,y resuspendido en 30 uL de agua libre de RNAsas.<\/p>\n

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RT-qPCR para la cuantificacio\u0301n de iNOS-mRNA<\/strong><\/p>\n

El RNA aislado se sometio\u0301 a transcripcio\u0301n inversa (RT); 1000 ng de cDNA se utilizaron para llevar a cabo la PCR, a partir de los siguientes para\u0301metros: la configuracio\u0301n inicial a 50\u00b0C durante dos minutos y luego 95\u00b0C durante diez minutos, seguido por 45 ciclos de 95\u00b0C, durante 15 segundos, y 60\u00b0C durante 60 s. La fluorescencia se controlo\u0301 en la etapa de recocido, y se generaron las gra\u0301ficas de amplificacio\u0301n. Un juego de oligonucleo\u0301tidos, iNOS FW (5′-GTT CTC AAG GCA CAG GTC TC-3 \u2018) y iNOS RV (5\u2019-GCA GGT CAC TTA TGT CAC TTA TC-3′), se utilizo\u0301 para amplificar un fragmento de 290- pb del gen de iNOS. La expresio\u0301n del RNA de GAPDH se utilizo\u0301 para normalizar la concentracio\u0301n del RNA en cada muestra analizada (Applied Biosystems, Foster City CA, nu\u0301mero de pieza 4326317E) de acuerdo con las especificaciones del fabricante.<\/p>\n

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RT-qPCR para la cuantificacio\u0301n del VHC-mRNA<\/strong><\/p>\n

El cDNA fue sometido a PCR en tiempo real para cuantificar el VHC y GAPDH-mRNA. (15) Las amplificaciones se llevaron a cabo por triplicado con los siguientes oligonucleo\u0301tidos: VHC FW (+75-93 nt) 5′-GCGTCTAGCCATGGCGTTA-3′; VHC RV (+138-157 nt) 5′-GGTTCCGCAGACCACTATGG-3 \u2018 y la sonda TaqMan (+94-110 nt) 5\u2019-FAM- CTGCACGACACTCATAC-NFQ-3′; las condiciones de amplificacio\u0301n fueron las siguientes: 50\u00b0C durante dos minutos, 95\u00b0C a diez minutos, seguido por 40 ciclos de 95\u00b0C por 15s y 60\u00b0C durante 60 segundos. Se utilizo\u0301 GAPDH-RNA para normalizar la concentracio\u0301n de RNA de VHC; su cuantificacio\u0301n se realizo\u0301 con el ensayo GAPDH (20X) (Applied Biosystems, Foster City, CA), de acuerdo con las especificaciones del fabricante.<\/p>\n

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Ensayos de transfeccio\u0301n transitoria con el vector pPROiNOs-Luc+<\/strong><\/p>\n

La regio\u0301n del nativa del promotor del gen iNOS se amplifico\u0301\u00a0por PCR a partir de DNA geno\u0301mico aislado de ce\u0301lulas Huh-7 con los oligonucleo\u0301tidos iNOS FW 5′-TAA GGT ACC AAT GCC ACA CCA AGC AGA CGC-3′ y iNOS RV 5′- AAT CCC GGG GAA CAC ACT GGC AGC CAA GAA-3′. Posteriormente, el promotor de iNOS se clono\u0301 en el vector pGL3- luciferasa (Promega, Madison, WI), con las enzimas KpnI y SmaI. El vector con el promotor-iNOS bajo el control de la RNA polimerasa de T7 y que tiene ri\u0301o abajo del gen de la luciferasa (pPROiNOs-Luc+), se utilizo\u0301 para ensayos de transfeccio\u0301n transitoria. Las transfecciones se llevaron a cabo en placas de seis pozos (Corning), utilizando Lipofectamina (Life-Techologies). (18) Las ce\u0301lulas se incubaron en medio libre de suero a 37\u00b0C durante seis horas, seguido por la adicio\u0301n de medio suplementado e incubacio\u0301n durante 24 y 48 h, para la posterior cuantificacio\u0301n de luciferasa como reportero de la actividad del promotor de iNOS en presencia de AAS y siRNA-iNOS, como monoterapia o terapia combinada.<\/p>\n

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Cuantificacio\u0301n de Luciferasa (Luc+)<\/strong><\/p>\n

Ce\u0301lulas transfectadas transitorios se lisaron en tampo\u0301n de lisis reportero, de acuerdo con las recomendaciones del fabricante (Promega), y se analizaron los lisados celulares de lucie\u0301rnaga y renilla expresio\u0301n de luciferasa con un lumino\u0301metro mediante el Dual-Glo sistema de ensayo de luciferasa (Promega).<\/p>\n

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Cuantificacio\u0301n nitritos<\/strong><\/p>\n

Los niveles de nitrito se determinaron por ensayo colorime\u0301trico, basado en la reaccio\u0301n de Griess (Promega), mediante el uso de normas de nitrito de sodio.<\/p>\n

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Silenciamiento ge\u0301nico con siRNA-iNOS en Huh-7 VHC<\/strong><\/p>\n

Secuencias de RNAs de interferencia (siRNA), con longitud de 21-22 pb que inhiben especi\u0301ficamente iNOS y GAPDH, se utilizaron de acuerdo a las especificaciones del fabricante (Ambion, Austin, TX). Las ce\u0301lulas contaban con 30 y 50% de confluencia en el momento de la transfeccio\u0301n. Los siRNAs se transfectaron a una concentracio\u0301n final de 150 nM, tanto para siRNA-iNOS como para siRNA-GAPDH (control positivo), con siPORT Lipid transfeccio\u0301n Agent (Ambion); como control negativo se selecciono\u0301 un siRNA non sense (Ambion). Las ce\u0301lulas se incubaron durante 24, 48 y 72 horas; posteriormente, se aislo\u0301 el RNA total para llevar a cabo la cuantificacio\u0301n de VHC mediante RT-qPCR.<\/p>\n

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Ana\u0301lisis estadi\u0301stico<\/strong><\/p>\n

Los experimentos se realizaron por triplicado y las variables se evaluaron mediante ANOVA, de una vi\u0301a y la prueba de Dunnet. Las diferencias se consideraron significativas con un valor de p \u2264 0.05.<\/p>\n

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RESULTADOS<\/strong><\/p>\n

AAS incrementa los niveles de NO en ce\u0301lulas Huh-7- VHC-replico\u0301n<\/strong><\/p>\n

Para confirmar la funcionalidad de iNOS, en nuestro modelo de estudio se cuantificaron los niveles de nitritos (NO2-), para determinar la produccio\u0301n de o\u0301xido ni\u0301trico (NO) indirectamente en el sobrenadante del medio de cultivo de ce\u0301lulas Huh7 VHC-replico\u0301n postratamiento con AAS. La cantidad de nitritos y nitratos producidos a partir de ce\u0301lulas de VHC- replico\u0301n fue significativamente mayor que en ce\u0301lulas parentales (sin VHC-replico\u0301n) (figura 1). Como era de esperar, AAS disminuye los niveles de NO, conforme transcurre el tiempo (concentracio\u0301n de nitritos); la inhibicio\u0301n ma\u0301xima se cuantifico\u0301 a las 72 h (90%) despue\u0301s del tratamiento (*p <0,05). Como control positivo las ce\u0301lulas de VHC-replico\u0301n, se trataron con el inhibidor de NO, L-N6- (1-iminoetil)-lisina (L-NIL) (250uM), y se observo\u0301 una disminucio\u0301n del nivel de nitritos, similares a los hallazgos con la exposicio\u0301n AAS (datos no mostrados). Los resultados antes mencionados sugieren la posibilidad de que el tratamiento AAS podri\u0301a modificar la capacidad de las ce\u0301lulas Huh7 VHC-replico\u0301n para expresar la enzima iNOS y posteriormente los niveles de NO, cuyo efecto depende del tiempo.<\/p>\n

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AAS reduce la expresio\u0301n de iNOS a nivel transcripcional<\/strong><\/p>\n

Se extrajo el RNA total de ce\u0301lulas Huh-7-VHC-replico\u0301n, expuestas a 4 mM de AAS, 1000 uM de arginina (donador de NO) o 100 uM de L-NIL (inhibidor de iNOS). Se llevo\u0301 a cabo una retrotranscripcio\u0301n para generar cDNA, y posteriormente se realizo\u0301 una PCR en tiempo real (sybr green) para el RNA derivado de ce\u0301lulas expuestas a AAS y PCR semicuantitativa con un juego de primers especi\u0301ficos para iNOS para el RNA aislado de los cultivos expuestos a arginina y L-NIL. Se normalizo\u0301 cada valor correspondiente a iNOS con los valores de los productos de PCR de actina (gen constitutivo).<\/p>\n

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La expresio\u0301n del RNA de iNOS en ce\u0301lulas Huh-7-VHC- replico\u0301n disminuyo\u0301 significativamente a las 24, 48 y 72 h (p< 0.05) postratamiento (AAS), a diferencia de las ce\u0301lulas sin el principio activo. A las 24h, la arginina duplico\u0301 los niveles de RNA de VHC, con respecto al control negativo (p < 0.05), mientras que L-NIL disminuyo\u0301 la si\u0301ntesis del RNA del replico\u0301n en 70% (p<0.05). Por lo tanto, AAS ejerce un efecto semejante al de arginina al inducir la sobreexpresio\u0301n de la enzima iNOS.<\/p>\n

\"fig_1_concentracion_NO\"<\/a><\/p>\n

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AAS estimula la nitracio\u0301n de protei\u0301nas con residuos de tirosina<\/strong><\/p>\n

Para evaluar si AAS es capaz de crear estre\u0301s nitrosativo en ce\u0301lulas hepa\u0301ticas, se preparo\u0301 un ensayo de Western blot, con un anticuerpo monoclonal que reconoce residuos de nitrotirosina, los cuales sirven como marcadores de estre\u0301s generado por especies reactivas de nitro\u0301geno. Se observo\u0301 un aumento del 2.57 veces (p < 0.05), en la cantidad de residuos de tirosina nitrados, en una protei\u0301na de ~ 75 KDa, en ce\u0301lulas Huh-7-VHC-replico\u0301n, a las 48h postratamiento (AAS), versus al control negativo (figura 2). Estos resultados sugieren que AAS puede promover un incremento en la cantidad de especies reactivas de nitro\u0301geno; sin embargo, a las 72 h el efecto se ve revertido, esto podri\u0301a atribuirse a la activacio\u0301n de vi\u0301a de proteosoma mediado por ubiquitina, ya que las protei\u0301nas oxidas y nitradas son altamente to\u0301xicas y deben eliminarse.<\/p>\n

\"fig_2_AAS\"<\/a><\/p>\n

Efecto del silenciamiento de iNOS sobre la expresio\u0301n de VHC<\/strong><\/p>\n

Para evaluar de fondo la participacio\u0301n de la enzima o\u0301xido ni\u0301trico sintasa inducible (iNOS), con la inhibicio\u0301n de la expresio\u0301n de VHC, se selecciono\u0301 un siRNA dirigido contra iNOS-mRNA para ser transfectado en ce\u0301lulas Huh7 VHC-replico\u0301n en presencia y ausencia de AAS. Se aislo\u0301 el RNA total, a las 24-36 horas postransfeccio\u0301n para cuantificar los niveles de iNOS-mRNA y RNA-VHC, mediante RT-qPCR. Se valido\u0301 que siRNA-iNOS disminuyera la expresio\u0301n de iNOS-mRNA alrededor de 70% en nuestro modelo in vitro.<\/p>\n

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Satisfactoriamente, los niveles de RNA-VHC se redujeron en las ce\u0301lulas infectadas con el VHC (Huh7 VHC-replico\u0301n), mostrando una reduccio\u0301n importante en 24 h postransfeccio\u0301n siRNA-iNOS (65%). Adicionalmente, se observo\u0301 que las ce\u0301lulas silenciadas y tratadas simulta\u0301neamente con 4 mM de AAS, presentaron una mayor disminucio\u0301n de los niveles de RNA-VHC, en comparacio\u0301n con las ce\u0301lulas no tratadas con la terapia combinada (figura 3). El control positivo de transfeccio\u0301n siRNA-GAPDH no tuvo ningu\u0301n efecto en los niveles de expresio\u0301n de iNOS-mRNA y ARN-VHC. El control negativo siRNA-non sense se utilizo\u0301 como control de\u00a0especificidad. En conjunto, estos resultados sugieren que la inactivacio\u0301n de iNOS inducida por VHC reduce su expresio\u0301n e incrementa el efecto antiviral de AAS (80%).<\/p>\n

\"fig_3_papel_silenciamiento\"<\/a><\/p>\n

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AAs inhibe la actividad del promotor de iNOS<\/strong><\/p>\n

Con el propo\u0301sito de analizar la participacio\u0301n de AAs sobre la actividad del promotor de iNOS se amplifico\u0301 la secuencia del promotor de iNO, y posteriormente se clonado en el vector expresio\u0301n comercial pGL3 basic, el cual contiene el gen reportero de luciferasa (Luc+). Una vez clonado el promotor en el pla\u0301smido e\u0301ste se contransfecto\u0301 con un constructo que expresa el gen reportero de renilla cuya expresio\u0301n es dirigida por el promotor de CMV.<\/p>\n

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La secuencia correspondiente al promotor de iNOS con una longitud de ~2Kb se amplifico\u0301 con un juego de primers especi\u0301ficos, y el producto se purifico\u0301 para despue\u0301s realizar una digestio\u0301n con las enzimas de restriccio\u0301n KpnI y SmaI; de forma simulta\u0301nea se digirio\u0301 el vector pGL3.<\/p>\n

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Los productos se purificaron, y posteriormente se ligaron. Al terminar la clonacio\u0301n, se transformaron bacterias E. coli y se hizo la seleccio\u0301n de clonas positivas para bacterias positivas para el pla\u0301smido con el pro-iNOS. El promotor se caracterizo\u0301 con las enzimas, de restriccio\u0301n BclI y SspI cuyas bandas corresponden al patro\u0301n teo\u0301rico esperado.<\/p>\n

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Una vez listo el pla\u0301smido se estandarizo\u0301 la cantidad de constructo para renilla y luciferasa con seis juegos diferentes de concentraciones. Para renilla 50 y 100ng y para Luc 100, 200, 300ng. Al final se eligieron 100ng de renilla y 200ng de luciferasa, ya que con estas cantidades se obtuvo la mejor sen\u0303al detectada por el lumino\u0301metro. Previo al experimento de cotransfeccio\u0301n y a la exposicio\u0301n con AAS, se llevo\u0301 a cabo un ensayo de viabilidad celular (figura 4).<\/p>\n

\"fig_4_ensayo_viabilidad\"<\/a><\/p>\n

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Ce\u0301lulas Huh-7-VHC-replico\u0301n se cotransfectaron con pPROiNOS-Luc + PCMV Renilla, y 6 h posterior a la transfeccio\u0301n se hizo la exposicio\u0301n a AAS a dos diferentes tiempos (24 y 48h). Al analizar los resultados, encontramos que AAS reduce la actividad del promotor hasta 60% (figura 5)<\/p>\n

\"fig_5_estrategia_general_oxidonitroso\"<\/a><\/p>\n<\/div>\n<\/div>\n<\/div>\n<\/div>\n<\/div>\n<\/div>\n

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Con base en los resultados hasta este punto, resumimos lo siguiente: AAS incrementa la concentracio\u0301n de NO y, parado\u0301jicamente, inhibe la expresio\u0301n de iNOS a nivel de RNA y protei\u0301na. El silenciamiento de iNOS reduce los niveles de RNA de VHC.<\/p>\n

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DISCUSIO\u0301N<\/strong><\/p>\n

En este estudio se evaluo\u0301 la participacio\u0301n de la enzima iNOS en la regulacio\u0301n negativa de RNA del VHC inducida por AAS. Observamos que el AAS reduce iNOS, disminuye la expresio\u0301n de iNOs a trave\u0301s de la actividad de su promotor; paralelamente, el mRNA y su protei\u0301na descienden junto con los niveles de expresio\u0301n de VHC. Otros grupos de investigacio\u0301n han reportado que los salicilatos pueden suprimir la expresio\u0301n de iNOS y COX-2, mediante su interaccio\u0301n con la protei\u0301na de unio\u0301n C\/EBP-b, la cual interactu\u0301a con promotores ge\u0301nicos para activar la transcripcio\u0301n. (17)<\/p>\n

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Tambie\u0301n se ha descrito la participacio\u0301n de AAS, a trave\u0301s de la vi\u0301a de sen\u0303alizacio\u0301n de COX-2; bajo este contexto, fue importante para este estudio la evaluacio\u0301n de la transactivacio\u0301n del promotor de iNOS durante el efecto antiviral de AAS contra VHC, ya que iNOS alberga la secuencia de reconocimiento para C\/EBP-b en su promotor. (18)<\/p>\n

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Adema\u0301s de la inhibicio\u0301n de la ciclooxigenasa, Machida et al. han indicado que la expresio\u0301n de la protei\u0301na del VHC per se puede aumentar la expresio\u0301n de iNOS. (11) Ellos demostraron que los hepatocitos infectados por el VHC generan un mayor nivel de mRNA de iNOS. Este trabajo sugiere que la infeccio\u0301n por VHC estimula la produccio\u0301n de NO a trave\u0301s de la activacio\u0301n de la expresio\u0301n de iNOS por las protei\u0301nas virales principales. (19) Estas observaciones sugieren que la produccio\u0301n de NO por la infeccio\u0301n por VHC juega un papel importante en la iniciacio\u0301n y la promocio\u0301n o la progresio\u0301n de ca\u0301ncer en los pacientes infectados por el VHC.<\/p>\n

En conclusio\u0301n, el AAS disminuye la expresio\u0301n de iNOS a nivel trasncripcional y traduccional y tambie\u0301n es capaz de reducir la actividad del promotor de iNOS; por otra parte, el silenciamiento de iNOS, mediante un sistema de RNA de interferencia (siRNA), induce un descenso en la replicacio\u0301n del VHC. Estudios en nuestro grupo de investigacio\u0301n sugieren un potencial efecto antioxidante del AAS, sustentado en la capacidad de este principio activo para incrementar la expresio\u0301n de supero\u0301xido dismutasa (SOD). Por lo tanto, las especies reactivas de nitro\u0301geno y oxi\u0301geno podri\u0301an considerarse como relevantes blancos terape\u0301uticos para el desarrollo de nuevas estrategias antivirales contra VHC.<\/p>\n

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RESUMEN<\/strong><\/p>\n

En ce\u0301lulas de hepatocarcinoma infectadas con el virus de la hepatitis C (VHC), el a\u0301cido acetil salici\u0301lico (AAS) disminuye los niveles del o\u0301xido ni\u0301trico sintasa inducible (iNOS), tanto en mRNA como en protei\u0301na. La exposicio\u0301n a AAS tambie\u0301n redujo la transactivacio\u0301n del promotor ge\u0301nico de iNOS en el modelo in vitro. Un ensayo de silenciamiento ge\u0301nico, con siRNA-iNOS descendio\u0301 el RNA del VHC (65%), y este efecto antiviral se incremento\u0301 en presencia de AAS (80%) en comparacio\u0301n con las ce\u0301lulas-control. Estos hallazgos sugieren que el o\u0301xido ni\u0301trico (NO) participa en la regulacio\u0301n del efecto antiviral de AAS sobre VHC.<\/p>\n

Palabras clave:<\/strong> VHC, siRNA-iNOS, AAS.<\/p>\n

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ABSTRACT<\/strong><\/p>\n

In hepatocarcinoma cells infected with the hepatitis C virus (HCV), acetylsalicylic acid (AAS) decreases the levels of mRNA and protein inducible nitric oxide synthase (iNOS). Exposure to AAS also reduced transactivation iNOS gene promoter in an in vitro model. An assay of gene silencing\u00a0using siRNA-iNOS decreased HCV RNA (65%) and this increased the antiviral effect in presence of AAS (80%) compared to cells-control. These findings suggest that nitric oxide (NO) is involved in the regulation of the antiviral effect of AAS on HCV.<\/p>\n

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Keywords:<\/strong> VHC, siRNA-iNOS, AAS.<\/p>\n

Agradecimientos<\/strong><\/p>\n

Los autores agradecen el apoyo financiero del Conacyt, nu\u0301mero de concesio\u0301n Salud-2008-C01-86996 y de BA\u0301SICA- CB2010-01-155082 para A.M. Rivas.<\/p>\n

Abreviaturas:<\/strong> AAS: a\u0301cido acetilsalici\u0301lico; VHC: virus de la hepatitis C; iNOS, de o\u0301xido ni\u0301trico sintasa inducible; NO: o\u0301xido ni\u0301trico; AINES: medicamentos antiinflamatorios, no esteroideos.<\/p>\n<\/div>\n<\/div>\n<\/div>\n<\/div>\n<\/div>\n<\/div>\n

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* Universidad Auto\u0301noma de Nuevo Leo\u0301n, FM.<\/p>\n

Contacto: amrivas1@yahoo.com<\/p>\n<\/div>\n

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Recibido: 23\/09\/15<\/p>\n

Aceptado: 23\/10\/15<\/p>\n<\/div>\n<\/div>\n<\/div>\n<\/div>\n<\/div>\n<\/div>\n<\/div>\n<\/div>\n<\/div>\n<\/div>\n<\/div>\n<\/div>\n<\/div>\n<\/div>\n<\/div>\n<\/div>\n<\/div>\n<\/div>\n<\/div>\n<\/div>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"

CLARA PATRICIA RI\u0301OS IBARRA*, SONIA LOZANO SEPU\u0301LVEDA*, LINDA MUN\u0303OZ ESPINOSA*, ANA ROSA RINCO\u0301N SA\u0301NCHEZ*, ANA MARI\u0301A RIVAS ESTILLA* CIENCIA UANL \/ AN\u0303O 18, No. 76, NOVIEMBRE-DICIEMBRE 2015 Art\u00edculo en PDF El virus de la hepatitis C (VHC) infecta aproximadamente a 3% de la poblacio\u0301n mundial y es un agente etiolo\u0301gico importante de la hepatitis cro\u0301nica, cirrosis hepa\u0301tica y ca\u0301ncer de […]<\/p>\n","protected":false},"author":2,"featured_media":5178,"comment_status":"closed","ping_status":"closed","sticky":false,"template":"","format":"standard","meta":{"_monsterinsights_skip_tracking":false,"_monsterinsights_sitenote_active":false,"_monsterinsights_sitenote_note":"","_monsterinsights_sitenote_category":0,"footnotes":""},"categories":[27],"tags":[],"class_list":["post-5170","post","type-post","status-publish","format-standard","has-post-thumbnail","hentry","category-investigacion"],"_links":{"self":[{"href":"https:\/\/cienciauanl.uanl.mx\/index.php?rest_route=\/wp\/v2\/posts\/5170","targetHints":{"allow":["GET"]}}],"collection":[{"href":"https:\/\/cienciauanl.uanl.mx\/index.php?rest_route=\/wp\/v2\/posts"}],"about":[{"href":"https:\/\/cienciauanl.uanl.mx\/index.php?rest_route=\/wp\/v2\/types\/post"}],"author":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/cienciauanl.uanl.mx\/index.php?rest_route=\/wp\/v2\/users\/2"}],"replies":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/cienciauanl.uanl.mx\/index.php?rest_route=%2Fwp%2Fv2%2Fcomments&post=5170"}],"version-history":[{"count":8,"href":"https:\/\/cienciauanl.uanl.mx\/index.php?rest_route=\/wp\/v2\/posts\/5170\/revisions"}],"predecessor-version":[{"id":5308,"href":"https:\/\/cienciauanl.uanl.mx\/index.php?rest_route=\/wp\/v2\/posts\/5170\/revisions\/5308"}],"wp:featuredmedia":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/cienciauanl.uanl.mx\/index.php?rest_route=\/wp\/v2\/media\/5178"}],"wp:attachment":[{"href":"https:\/\/cienciauanl.uanl.mx\/index.php?rest_route=%2Fwp%2Fv2%2Fmedia&parent=5170"}],"wp:term":[{"taxonomy":"category","embeddable":true,"href":"https:\/\/cienciauanl.uanl.mx\/index.php?rest_route=%2Fwp%2Fv2%2Fcategories&post=5170"},{"taxonomy":"post_tag","embeddable":true,"href":"https:\/\/cienciauanl.uanl.mx\/index.php?rest_route=%2Fwp%2Fv2%2Ftags&post=5170"}],"curies":[{"name":"wp","href":"https:\/\/api.w.org\/{rel}","templated":true}]}}