Art\u00edculo completo en PDF<\/a><\/p>\n El presente arti\u0301culo esta\u0301 basado en la investigacio\u0301n \u201cEstudio de la formacio\u0301n de las ce\u0301lulas espumosas en el actinomicetoma experimental inducido por Nocardia brasiliensis\u201d, galardonada con el Premio de Investigacio\u0301n UANL 2013, en la categori\u0301a de Ciencias de la Salud, otorgado en sesio\u0301n solemne del Consejo Universitario, en septiembre de 2013.<\/p>\n Las ce\u0301lulas espumosas se caracterizan por haber acumulado li\u0301pidos y esta\u0301n presentes en el arterioesclerosis, algunas enfermedades de almacenamiento lisoso\u0301mico y varias enfermedades infecciosas, como malaria, dengue y tuberculosis, las cuales siguen siendo problemas de salud mundial. Aunque se desconoce el papel exacto de las ce\u0301lulas espumosas en las enfermedades infecciosas, hay indicaciones que son aprovechadas por los diferentes pato\u0301genos para sobrevivir. (1, 2) Las ce\u0301lulas espumosas se han observado tambie\u0301n en el actinomicetoma experimental por Nocardia brasiliensis (Nb). (3)<\/p>\n Nb es una bacteria Gram+, aero\u0301bica, con una pared celular con abundantes a\u0301cidos mico\u0301licos que podri\u0301an fungir como factor de virulencia (4) cuando este sapro\u0301fito se convierte en pato\u0301geno facultativo despue\u0301s de una infeccio\u0301n trauma\u0301tica y accidental. (5) Otros factores de virulencia son la catalasa y la supero\u0301xido dismutasa, enzimas que neutralizan los radicales to\u0301xicos generados por el estallido respiratorio de la respuesta inmune. (6, 7)<\/p>\n Me\u0301xico es una regio\u0301n ende\u0301mica del actinomicetoma por Nb, y el pato\u0301geno fa\u0301cilmente desarrolla resistencia al tratamiento antibio\u0301tico, por lo que muchas veces se recurre a la amputacio\u0301n de extremidades, lugar ma\u0301s comu\u0301nmente afectado por la enfermedad. El actinomicetoma es una infeccio\u0301n subcuta\u0301nea que afecta igual a tejidos subyacentes como mu\u0301sculo y hueso. Hay edema con cicatrizacio\u0301n en lugares donde ha ocurrido drenaje de gra\u0301nulos de bacterias desde las fi\u0301stulas internas. Histolo\u0301gicamente, se observan microabscesos multiloculares con principalmente polimorfonucleares (PMN) que rodean\u00a0el grano bacteriano central. En la periferia se observan linfocitos, mientras que las ce\u0301lulas espumosas se encuentran entrelazadas en la ca\u0301psula fibrosa. (8)<\/p>\n Para estudiar la respuesta inmune contra el pato\u0301geno se ha desarrollado un modelo experimental en ratones BALB\/c. (7) Ti\u0301picamente, la inflamacio\u0301n aguda llega a su ma\u0301ximo una semana despue\u0301s de la inoculacio\u0301n. La infeccio\u0301n cro\u0301nica (actinomicetoma) se desarrolla despue\u0301s de cuatro semanas con una inflamacio\u0301n severa y la deformacio\u0301n del tejido. La abundante presencia de PMN refleja una respuesta inmune innata cro\u0301nica, mientras que la presencia local de la interleucina (IL) 12 e interfero\u0301n gamma (IFN-\u03b3) (8,9) indican la activacio\u0301n de la respuesta inmune celular o de linfocitos T cooperadores tipo 1 (Th1). Adema\u0301s se activa la respuesta inmune humoral o tipo Th2, en la que, aparte de la produccio\u0301n de anticuerpos IgG, (7,10) niveles sostenidos de IgM relativamente altos parecen ser importantes en la proteccio\u0301n de una manera independiente del complemento. (11,12)<\/p>\n A pesar de esto, el pato\u0301geno sobrevive y la enfermedad sigue desarrolla\u0301ndose. Estudios sugieren que el pato\u0301geno podri\u0301a refugiarse para evadir la respuesta inmune hospedero, como se ha descrito en los casos de tuberculosis y lepra. En estas enfermedades, los pato\u0301genos causantes se establecen en macro\u0301fagos espumosos. (1,13) Se han reportado modelos in vitro para estudiar la formacio\u0301n de macro\u0301fagos espumosos al retarlos con los pato\u0301genos involucrados. (1,13) Sin embargo, estudios inmunohistoqui\u0301micos sugieren que igual podri\u0301an ser ce\u0301lulas dendri\u0301ticas. (3,14)<\/p>\n La falta de exclusividad de marcadores para macro\u0301fagos y ce\u0301lulas dendri\u0301ticas dificulta la interpretacio\u0301n de tales estudios. Por lo anterior, estudiamos in vivo<\/em> el linaje de las ce\u0301lulas espumosas, adema\u0301s del tipo de microambiente en la lesio\u0301n, enfoca\u0301ndonos en la expresio\u0301n de las citocinas involucradas en la diferenciacio\u0301n local de monocitos en macro\u0301fagos o ce\u0301lulas dendri\u0301ticas: el GM-CSF (proinflamatorio),\u00a0M-CSF, IL-4 e IL-13 ( \u0301antiinflamatorio \u0301), y de los marcadores de activacio\u0301n cla\u0301sica (nos2\/iNOS) o alternativa (chi3l3\/Ym1 y retnla\/FIZZ1)15, 16 de los fagocitos.<\/p>\n METODOLOGI\u0301A<\/strong><\/p>\n Modelo experimental<\/strong><\/p>\n Ratones BALB\/c fueron mantenidos bajo condiciones controlados con agua y alimento para roedores (Purina) ad libitum, y se manipularon con respeto a las normas e\u0301ticas y de investigacio\u0301n establecidas por el Comite\u0301 Institucional y referidas en la NOM 062- 200-1999. El Comite\u0301 Bioe\u0301tica Institucional aprobo\u0301 el protocolo de investigacio\u0301n (IN 10-003).<\/p>\n La cepa ATCC 700358 de Nb se cultivo\u0301 durante tres di\u0301as, a 37\u00b0C, hasta su fase log de crecimiento en infusio\u0301n cerebro- corazo\u0301n (BHI, Oxoid). La peli\u0301cula bacteriana se lavo\u0301 con 0.85% de solucio\u0301n salina (SS) a 1600 g, y fue homogeneizada en 10 ml SS con un Potter. Despue\u0301s de 10 min de reposo se recupero\u0301 la parte no sedimentada del homogeneizado.<\/p>\n Generacio\u0301n y marcaje de macro\u0301fagos y ce\u0301lulas dendri\u0301ticas derivados de la me\u0301dula o\u0301sea (MDMO y DCDMO, resp.)\u00a0<\/strong><\/p>\n La me\u0301dula o\u0301sea de los fe\u0301mures y tibias de un rato\u0301n (de seis semanas en adelante) se recupero\u0301 en medio de RPMI 1640\/25mM HEPES\/24 mM bicarbonato, adicionado con penicilina 50-100 U\/ml y estreptomicina 50-100 \u03bcg\/mL (todos los reactivos de Sigma; RPMI incompleto), homogeneizado por pipeteo y lavado (400 g, 8-10 min.). La aplicacio\u0301n de un hemo\u0301lisis con 0.8% NH4Cl\/0.08% NaHCO3\/ 0.04% EDTA en H2O, durante 10 min a 21-25\u00b0C con agitacio\u0301n gentil, seguido de dos lavados en RPMI incompleto, fue esta\u0301ndar para la generacio\u0301n de DCDMO y opcional para MDMO.<\/p>\n Una muestra de la suspensio\u0301n celular, diluida 1:10 con 2% a\u0301cido ace\u0301tico\/10 mM amortiguador de fosfatos, pH 7.3 (PBS), fue contada con un hemocito\u0301metro. Las ce\u0301lulas fueron sembradas a 1×105 ce\u0301lulas\/cm2 en cajas Petri (Corning 430293) en medio de diferenciacio\u0301n apropiado, lo cual consisti\u0301a de RPMI completo (= RPMI incompleto suplementado con 10% suero bovino fetal inactivado por calor, 30 min. 56\u00b0C), suplementado con 30% medio condicionado de L929 para generar MDMO y para DCDMO con 20 ng\/ml GM-CSF recombinante ma\u0301s 20 ng\/mL IL-4 recombinante (Peprotech, No. 315-03 y 214-04, respectivamente). La mitad del medio fue reemplazada cada segundo o tercer di\u0301a hasta su diferenciacio\u0301n a di\u0301a 6.<\/p>\n Las ce\u0301lulas diferenciadas fueron cargadas con 2 \u03bcM succinimidil e\u0301ster de carboxifluorescei\u0301na (CFSE), segu\u0301n las instrucciones del proveedor (Molecular Probes). Uno a tres di\u0301as despue\u0301s del marcaje, las ce\u0301lulas fueron cosechadas en fri\u0301o con escrapers, homogeneizadas por pipeteo y lavadas en RPMI completo. Para eliminar los macro\u0301fagos \u201ccontaminantes\u201d del cultivo de las DCDMO, los macro\u0301fagos se marcaron con anti-F4\/80 conjugado con biotina (eBioscience) diluida 1:100 en RPMI completo, durante 15 min a 21-25\u00b0C ma\u0301s 30 min a 4\u00b0C, y se lavaron con PBS o RPMI, despue\u0301s se aplico\u0301 la deplecio\u0301n con perlas magne\u0301ticas conjugadas con streptavidina y una columna MS (Miltenyi Biotec), segu\u0301n las instrucciones del proveedor.<\/p>\n Inmunofenotipificacio\u0301n por citometri\u0301a de flujo<\/strong><\/p>\n Los receptores Fc se bloquearon con suero hiperinmune de rato\u0301n 1:50 (10 min, 21-25\u00b0C). Des- pue\u0301s se incubaron durante 30 min a 4\u00b0C, con los anticuerpos especi\u0301ficos diluidos en RPMI completo. Se usaron CD11b-APC (1:300) con CD11c-PE (1:80), F4\/80-PE (un marcador de macro\u0301fagos;\u00a01:160) con CD205-APC (un marcador de ce\u0301lulas dendri\u0301ticas; 1:1250), todos de eBioscience, adema\u0301s de controles de isotipo conjugado con PE (1:100; Caltag) y un control sin anticuerpo. Despue\u0301s de 2-3 lavados en 2 ml de PBS fri\u0301o (400 g, 10 min), las ce\u0301lulas fueron resuspendidas y fijadas en 550 \u03bcl 0.37% formaldehido\/PBS, y almacenadas a 4\u00b0C en la oscuridad hasta su lectura. Se analizaron > 10,000 ce\u0301lulas\/muestra en un FACS-Calibur (BD Bioscience) o un FACS-Canto II (BD Bioscience).<\/p>\n Prueba de fagocitosis<\/strong><\/p>\n MDMO adherentes se incubaron con microesferas de La\u0301tex carboxilado de 2 \u03bcm (Polysciences), en una razo\u0301n de 10-30 microesferas\/ce\u0301lula, en RPMI completo durante 1-4 h a 37\u00b0C . La fagocitosis fue detenida por la adicio\u0301n de 2-3 volu\u0301menes de PBS fri\u0301o y se realizaron lavados para eliminar microesferas libres. Las ce\u0301lulas se fijaron con 10% de formalina durante 10 min, y fueron guardadas en PBS. Se contaron 100 ce\u0301lulas por duplicado para determinar el i\u0301ndice de fagocitosis.<\/p>\n Transferencia adoptiva de ce\u0301lulas marcadas<\/strong><\/p>\n Se inyectaron 100 \u0303\u03bcl de una suspensio\u0301n celular\/PBS (equivalente a 5×104-5×105 ce\u0301lulas CFSE+ totales) en una lesio\u0301n > 15 di\u0301as.<\/p>\n Infeccio\u0301n de ratones y obtencio\u0301n de biopsias<\/strong><\/p>\n El cojinete plantar izquierdo de ratones hembras (8- 11 semanas) se inyecto\u0301 con 1×106 unidades formadoras de colonias en fase log de crecimiento de la cepa ATCC 700358 de Nb. (7) Se monitoreo\u0301 el desarrollo de la lesio\u0301n con la fo\u0301rmula del elipsoide (V = 4\/3\u03c0* 1\u20442 longitud * 1\u20442 grosor * 1\u20442 anchura). Para experimentos de expresio\u0301n ge\u0301nica, en los tiempos<\/p>\n<\/div>\n<\/div>\n<\/div>\n indicados, los ratones se sacrificaron (n = 5) por dis- locacio\u0301n cervical, y una biopsia de la lesio\u0301n se coloco\u0301 en 1 mL Trizol (Invitrogen) para la determinacio\u0301n de la expresio\u0301n ge\u0301nica. Las muestras fueron homogeneizadas con un TissueTearer a 0-4\u00b0C y despue\u0301s incubadas durante 15-20 min. a 21-25\u00b0C, antes de almacenarlas a -80\u00b0C. Para los estudios de linaje, a los di\u0301as 1, 3 o 7 despue\u0301s de la transferencia adoptiva (n = 3-5), se tomaron biopsias (sin huesos), las cuales se fijaron inmediatamente.<\/p>\n Preparacio\u0301n histolo\u0301gica<\/strong><\/p>\n Despue\u0301s de fijar las biopsias en 10% de formalina durante 8h, se realizaron tres lavados (2-8h\/lavado) en 10 mM PBS (pH 7.3), y se guardaron > 18h en 30% sucrosa (Sigma)\/PBS a 4\u00b0C, procurando la oscuridad en todo el proceso. Posteriormente, las biopsias fueron semisecadas, antes de incluirlas en OCT (TissueTek), y congeladas a -20oC. Se realizaron cortes de criostato de 10 \u03bcm a tres diferentes profundidades de la biopsia, los cuales se recolectaron en un portaobjetos cubierto con Polysine (ThermoScientific) por triplicado, e inmediatamente se mantuvieron en la oscuridad, antes de su almacenamiento, a -20\u00b0C hasta su uso. Para la tincio\u0301n de las gotas lipi\u0301dicas, los cortes fueron incubados con el fluorocromo Rojo de Nilo\/PBS (300 ng\/mL), preparado desde un stock de 1mg\/ml en metanol, durante 15 min a 21-25\u00b0C, posteriormente se lavaron 2-3 veces con PBS. Las laminillas fueron montadas en Vectashield con DAPI (Vector Laboratories), selladas con un esmalte transparente y analizadas con un microscopio confocal LSM700 o LSM710, controlado por software Zen2011 (Zeiss). Las configuraciones para la visualizacio\u0301n fueron: DAPI \u03bbex\/em = 360\/458-531 nm para nu\u0301cleos, CFSE \u03bbex\/em = 488\/ 490-569 nm para ce\u0301lulas transferidas, y Rojo de Nilo \u03bbex\/em = 591\/594-692 nm para gotas lipi\u0301dicas.<\/p>\n Obtencio\u0301n de RNA y qRT-PCR<\/strong><\/p>\n Se extrajo el RNA de los homogeneizados en Trizol, segu\u0301n las instrucciones del proveedor (Invitrogen). Un tratamiento con DNasa (Promega), segu\u0301n las instrucciones del proveedor, fue incluido para eliminar DNA y seguido de una reextraccio\u0301n del RNA, lo cual se recupero\u0301 en H2O tratado con dietilpirocarbonato. Se aplico\u0301 espectrofotometri\u0301a (SmartSpec, BioRad) para determinar la concentracio\u0301n y la pureza. El criterio de la pureza fue un 260\/280 > 1.7. Dos \u03bcg RNA fue retrotranscrito durante 1h a 37oC, con 10 mM dNTP (Epicentre), 10 ng\/\u03bcl solucio\u0301n de sondas al azar (Invitrogen) y 1 \u03bcl transcriptasa inversa (M- MLV-RT; Invitrogen) en el buffer recomendado por el proveedor, en un volumen final de 20 \u03bcl.<\/p>\n La concentracio\u0301n y pureza del cDNA se determinaron por espectrofotometri\u0301a, como se describio\u0301 antes. Por duplicado, se amplifico\u0301 500 ng de cDNA en un volumen final de 20 \u03bcl con deteccio\u0301n por: 1) el me\u0301todo de SYBRGreen, usando el IQTM SYBRGreen Supermix (BioRad), 5 pmol de cada primer (tabla I) y el siguiente esquema de amplificacio\u0301n: 50\u00b0C por 10 min, 90\u00b0C por 3 min, y 40 ciclos de 90\u00b0C por 30s y la temperatura o\u0301ptima (Topt) \u00b0C por 30 s (tabla I), o 2) el me\u0301todo Taqman, usando las soluciones de primers y sondas Taqman (Applied Biosystems, tabla I) a 40x y el IQTM Supermix (BioRad) con un programa de termociclador, segu\u0301n las indicaciones del proveedor (Applied Biosystems). La expresio\u0301n ge\u0301nica se formulo\u0301 como expresio\u0301n relativa, calculada con el me\u0301todo de Livak, y con la fo\u0301rmula de 2\u2013 \u0303\u2206\u2206Ct, con el gliceraldehi\u0301do-3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) como referencia y relativo a la expresio\u0301n de la primera deteccio\u0301n durante el desarrollo.<\/p>\n<\/div>\n<\/div>\n Ana\u0301lisis estadi\u0301stico<\/strong><\/p>\n Los experimentos se realizaron por lo menos dos veces. Se aplico\u0301 la prueba T de Student para comparar\u00a0dos grupos con distribucio\u0301n normal. La prueba de ANOVA con prueba posterior de Tukey se utilizo\u0301 para la comparacio\u0301n mu\u0301ltiple de > 2 grupos con distribucio\u0301n parame\u0301trico. En todas las pruebas estadi\u0301sticas, se considero\u0301 un P < 0.05 como valor significativo.<\/p>\n RESULTADOS<\/strong><\/p>\n El fenotipo y la funcionalidad de los fagocitos no son alterados por el marcaje<\/strong><\/p>\n La diferenciacio\u0301n de ce\u0301lulas de la me\u0301dula o\u0301sea con el medio condicionado genero\u0301 macro\u0301fagos con su morfologi\u0301a ti\u0301pica (figura 1), y con > 98% de las ce\u0301lulas cosechadas positivas para el marcador de macro\u0301fagos murinos F4\/80. Sin embargo, la diferenciacio\u0301n de ce\u0301lulas de la me\u0301dula o\u0301sea con GM-CSF + IL-4 genero\u0301 una mezcla de ce\u0301lulas dendri\u0301ticas semiadherentes, macro\u0301fagos adherentes y PMN en suspensio\u0301n. Estos u\u0301ltimos fueron fa\u0301cilmente eliminados al descartar el medio de cultivo seguido de lavados de las ce\u0301lulas adherentes. Sin embargo, eliminar macro\u0301fagos fue ma\u0301s importante, considerando el objetivo del estudio. No confiamos en la te\u0301cnica de la seleccio\u0301n positiva de ce\u0301lulas CD11c+ o CD205+, ya que estos marcadores ocurren tambie\u0301n en subgrupos de macro\u0301fagos,17,18 decidimos por una deplecio\u0301n de macro\u0301fagos F4\/80+, con lo cual aceptamos la posible pe\u0301rdida de algunas ce\u0301lulas dendri\u0301ticas F4\/80+,19, 20 pero asegurando mayor pureza de las ce\u0301lulas dendri\u0301ticas. Logramos disminuir el porcentaje ce\u0301lulas F4\/80+ de > 33% a < 4.5% en las DCDMO.<\/p>\n<\/div>\n El marcaje de MDMO y DCDMO, con 2 \u03bcM CFSE, causo\u0301 un cambio transitorio en su morfologi\u0301a. Los MDMO obtuvieron una apariencia ma\u0301s redonda y la adherencia al sustrato disminuyo\u0301 temporalmente. Sin embargo, al di\u0301a siguiente habi\u0301an recuperado su morfologi\u0301a ti\u0301pica. La inmunotipificacio\u0301n de las ce\u0301lulas marcadas fue similar a la de las ce\u0301lulas no marcadas (tabla II). El marcaje tampoco afecto\u0301 la funcionalidad de los macro\u0301fagos. El i\u0301ndice de fagocitosis de macro\u0301fagos CFSE+ fue 0.96 (+ 0.03) y el de las ce\u0301lulas control 0.975 (+ 0.02); no hubo una diferencia significativa entre los grupos (tabla II).<\/p>\n<\/div>\n Macro\u0301fagos y ce\u0301lulas dendri\u0301ticas marcadas acumularon gotas lipi\u0301dicas<\/strong><\/p>\n Los macro\u0301fagos y ce\u0301lulas dendri\u0301ticas que se habi\u0301an transferido en una infeccio\u0301n de 30 di\u0301as se localizaron siete di\u0301as despue\u0301s en la periferia de los microabscesos, yuxtapuestos a los fibroblastos (figura 2 a y b, respectivamente), el lugar ti\u0301pico de las ce\u0301lulas espumosas. Adema\u0301s, al ten\u0303irlos con Rojo de Nilo, se comprobo\u0301 que habi\u0301an acumulados gotas lipi\u0301dicas (figura 2 c y d). Obviamente, tambie\u0301n macro\u0301fagos y ce\u0301lulas dendri\u0301ticas del hospedero podri\u0301an acumular gotas lipi\u0301dicas, por lo cual algunas ce\u0301lulas mostradas se tin\u0303eron de rojo, sin tener la sen\u0303al del CFSE en verde.<\/p>\n La expresio\u0301n relativa in situ de IL-13 y GM-CSF aumenta durante la infeccio\u0301n con Nb<\/strong><\/p>\n La expresio\u0301n de csf1\/M-CSF aumento\u0301 durante la inflamacio\u0301n, con un expresio\u0301n relativa (ER) ma\u0301ximo de 5.7x (SEM 1.6) al di\u0301a 7, pero no hubo diferencia significativa (P = 0.184) en comparacio\u0301n con el di\u0301a 0 o con otros tiempos. El csf2\/GM-CSF no fue detectable en homeostasis; pero, una vez detectado\u00a0en un rato\u0301n a 0.5 di\u0301as y en todos los ratones a un di\u0301a, continuo\u0301 aumentando su expresio\u0301n mientras transcurri\u0301a la infeccio\u0301n, so\u0301lo interrumpida con una disminucio\u0301n temporal a di\u0301a 15. En el di\u0301a 60 se expreso\u0301 ma\u0301s csf2\/GM-CSF, con una ER de 129x, SEM 55 (figura 3). Con respecto a las citocinas Th2, la IL-4 no se detecto\u0301 en la homeostasis, y solamente a niveles muy bajos durante la inflamacio\u0301n aguda.<\/p>\n Con excepcio\u0301n del grupo de 0.5 di\u0301a, al menos un rato\u0301n no expresari\u0301a un nivel detectable de IL-4 en los diferentes grupos de inflamacio\u0301n. No hubo diferencia significativa entre los grupos que expresaron IL-4. Por otro lado, la expresio\u0301n de IL-13 aumento\u0301 durante la inflamacio\u0301n aguda (ER 60x, SEM 18), pero sin significancia estadi\u0301stica, y despue\u0301s de una disminucio\u0301n temporal durante la semirresolucio\u0301n de la fase aguda, la expresio\u0301n se incremento\u0301 de nuevo y significativamente durante la inflamacio\u0301n cro\u0301nica (ER 152x, SEM 35, p = 0.003) (figura 3). El coeficiente de correlacio\u0301n entre el taman\u0303o de la lesio\u0301n y las ER de GM-CSF y de IL-13 fueron, respectivamente, 0.885 y 0.929. Por tanto, tambie\u0301n hubo una buena correlacio\u0301n entre si\u0301 de 0.97 (figura 4).<\/p>\n Los marcadores de macro\u0301fagos M2 demuestran un perfil de expresio\u0301n opuesto<\/strong><\/p>\n La expresio\u0301n del marcador de la activacio\u0301n cla\u0301sica de macro\u0301fagos, nos2\/iNOS aumento\u0301 de manera significativa (P < 0.0001), inmediatamente despue\u0301s de infectar los ratones, alcanzo\u0301 su ma\u0301xima ER durante la inflamacio\u0301n aguda (di\u0301a 7: ER 922, SEM 177, P = 0.0008), despue\u0301s disminuyo\u0301, pero sostuvo un aumento significativo en comparacio\u0301n con el control (di\u0301a 60, ER 623, SEM 222; P< 0.02) (figura 3).<\/p>\n![\"2\"](\"http:\/\/rodrigosotomoreno.com\/revistanew\/wp-content\/uploads\/2014\/01\/2-150x150.jpg\")
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