{"id":3080,"date":"2015-01-21T10:50:21","date_gmt":"2015-01-21T16:50:21","guid":{"rendered":"http:\/\/cienciauanl.uanl.mx\/?p=3080"},"modified":"2015-02-16T10:02:02","modified_gmt":"2015-02-16T16:02:02","slug":"deteccion-de-micrornas-extracelulares-y-su-potencial-como-biomarcadores-moleculares","status":"publish","type":"post","link":"https:\/\/cienciauanl.uanl.mx\/?p=3080","title":{"rendered":"Detecci\u00f3n de microRNAs extracelulares y su potencial como biomarcadores moleculares"},"content":{"rendered":"

\"deteccionmicrornamarcadores\"<\/a><\/p>\n

FERM\u00cdN MAR AGUILAR*, MARIO R. MORALES VALLARTA*, CRISTINA RODR\u00cdGUEZ PADILLA*,
\nDIANA RES\u00c9NDEZ P\u00c9REZ*<\/p>\n

CIENCIA UANL \/ A\u00d1O 18, No. 71, ENERO-FEBRERO 2015<\/a><\/p>\n

Art\u00edculo en PDF<\/a><\/p>\n

\"premioinvestigacion2014\"<\/a><\/p>\n

Los biomarcadores son mol\u00e9culas que, al detectarse en tejidos biol\u00f3gicos, sirven como indicadores de las funciones normales o patol\u00f3gicas de un organismo. Un biomarcador ideal debe adaptarse a una serie de criterios en funci\u00f3n de c\u00f3mo va a utilizarse; debe ser accesible a trav\u00e9s de m\u00e9todos no invasivos, espec\u00edfico para la patolog\u00eda de inter\u00e9s y confiable para la detecci\u00f3n de la enfermedad.<\/p>\n

La mayor\u00eda de los biomarcadores detectables en sangre, en la actualidad, se basa en los niveles de prote\u00ednas espec\u00edficas en la sangre. Aunque las prote\u00ednas son muy diversas y potencialmente muy informativas, diversos desaf\u00edos hacen que el descubrimiento y desarrollo de nuevos biomarcadores basados en prote\u00ednas sea una tarea costosa e intensiva. Estos desaf\u00edos incluyen la complejidad de la composici\u00f3n de prote\u00ednas en la sangre, la diversidad de las modificaciones postraduccionales y las dificultades en el desarrollo adecuado de agentes de detecci\u00f3n de alta afinidad. (1)<\/p>\n

Los microRNAs (miRNAs) son mol\u00e9culas peque\u00f1as de RNA con una longitud promedio de 22 nucle\u00f3tidos, y con importantes funciones regulatorias a nivel postranscripcional, tanto en plantas como en animales. (2) Recientemente, se ha observado que estas mol\u00e9culas re\u00fanen muchas caracter\u00edsticas de los buenos biomarcadores, por ejemplo, son estables en muchos fluidos corporales, y las secuencias de la mayor\u00eda se conservan entre especies diferentes. Adem\u00e1s, el nivel de expresi\u00f3n de los miRNAs puede evaluarse con facilidad por varios m\u00e9todos, entre los que se incluye la reacci\u00f3n en cadena de la polimerasa (PCR).<\/p>\n

Otra ventaja de los miRNAs como biomarcadores es su expresi\u00f3n espec\u00edfica para los tejidos y representa muy bien su estado fisiol\u00f3gico. El perfil de expresi\u00f3n miRNAs definido se ha observado en patolog\u00edas que van desde el c\u00e1ncer hasta enfermedades parasitarias. (3-6)<\/p>\n

Uno de los retos para combatir el c\u00e1ncer de mama es encontrar un biomarcador m\u00ednimamente invasivo, sensible y espec\u00edfico que facilite la detecci\u00f3n de esta enfermedad, el seguimiento del paciente y su respuesta al tratamiento.<\/p>\n

Los estudios realizados sobre la expresi\u00f3n de los miRNAs en c\u00e1ncer de mama indican que estas mol\u00e9culas son espec\u00edficas y, por sus caracter\u00edsticas antes mencionadas, tienen potencial para ser excelentes biomarcadores y herramientas de pron\u00f3stico en esta patolog\u00eda. (7,8.)<\/p>\n

En cuanto a las enfermedades parasitarias, se postula que los miRNAs podr\u00edan influenciar la expresi\u00f3n g\u00e9nica en su hospedero para facilitar la infecci\u00f3n y controlar su respuesta inmune. (9) Algunos de los miRNAs identificados en par\u00e1sitos han mostrado potencial para la identificaci\u00f3n de una especie espec\u00edfica. (10) Sin embargo, la identificaci\u00f3n de miRNAs en estos organismos sigue siento bastante limitada, y se necesitan ensayos de secuenciaci\u00f3n para caracterizar estas mol\u00e9culas y descubrir nuevos biomarcadores.<\/p>\n

En el presente trabajo se muestra que el perfil de expresi\u00f3n de miRNAs permite distinguir con alta sensibilidad, especificidad y eficiencia entre pacientes con c\u00e1ncer mamario (CM) e individuos sanos. La combinaci\u00f3n de tres miRNAs usados al mismo tiempo como un solo grupo eleva significativamente la eficiencia de la prueba en c\u00e1ncer mamario. La alta estabilidad de los miRNAs en suero sangu\u00edneo permiti\u00f3 su detecci\u00f3n, y nos permite postular que tienen potencial para convertirse en una herramienta de diagn\u00f3stico no invasiva. Adicionalmente, en nuestro laboratorio se secuenciaron por primera vez los miRNAs de Entamoeba histolytica, lo que permiti\u00f3 detectar 199 miRNAs no descritos anteriormente, y este hallazgo fue validado mediante la determinaci\u00f3n de la expresi\u00f3n de los miRNAs con microarreglos y por RT-PCR tiempo real. Este hallazgo constituye el primero en su tipo, y supone el inicio de la b\u00fasqueda de la funci\u00f3n de los miRNAs de E. histolytica.<\/p>\n

METODOLOG\u00cdA<\/strong><\/p>\n

Las muestras de tejido y suero sangu\u00edneo de pacientes con c\u00e1ncer de mama, as\u00ed como de pacientes con amibiasis, se almacenaron a -70\u00b0C hasta su utilizaci\u00f3n.<\/p>\n

Para la extracci\u00f3n de los RNAs totales de las muestras de tejido de CM, de los sueros sangu\u00edneos y trofozo\u00edtos de E. histolytica HM1-IMSS, se utiliz\u00f3 el Kit miRNeasy, con base en el protocolo del fabricante.<\/p>\n

PCR tiempo real<\/em><\/p>\n

Las muestras de tejido y suero sangu\u00edneo de pacientes con c\u00e1ncer mamario fueron amplificadas por PCR tiempo real, con sondas Taqman, de acuerdo a las instrucciones del proveedor. La cuantificaci\u00f3n fue realizada por medio del m\u00e9todo de 2-\u02dcCt, con tejido y suero sangu\u00edneo de mujeres sanas como calibrador.<\/p>\n

Secuenciaci\u00f3n de nueva generaci\u00f3n (NGS)<\/strong><\/p>\n

La biblioteca de DNAc fue secuenciada en el equipo Illumina Gallx, a partir de las instrucciones del proveedor. Las lecturas de la secuenciaci\u00f3n sin procesar se obtuvieron con el software de Illumina Sequencing Control Studio versi\u00f3n 2.8 (SCS v2.8), seguido del an\u00e1lisis de imagen de secuenciaci\u00f3n en tiempo real y lectura autom\u00e1tica de nucle\u00f3tidos de Illumina Real-Time Analysis versi\u00f3n 1.8.70 (RTA v1.8.70). El an\u00e1lisis de las secuencias obtenidas se realiz\u00f3 con el programa ACGT101-miR v4.2 (LC Sciences). (11-13)<\/p>\n

RESULTADOS<\/strong><\/p>\n

En el presente estudio, se determin\u00f3 la expresi\u00f3n diferencial de miR-10b, miR-21, miR-125b, miR-145, miR-155 y miR-191 en 50 pacientes con c\u00e1ncer de mama, con respecto a la expresi\u00f3n de estos miRNAs en 20 tejidos normales de mama. Despu\u00e9s del an\u00e1lisis estad\u00edstico, se seleccionaron los miRNAs que presentaron desregulaci\u00f3n estad\u00edsticamente significativa (miR-21, miR-125b y miR-191), para determinar sus niveles de expresi\u00f3n. La expresi\u00f3n relativa de miR-21 y miR-191 fue m\u00e1s alta en el tejido de c\u00e1ncer de mama, con respecto al tejido normal, mientras que la expresi\u00f3n de miR-125b present\u00f3 menor expresi\u00f3n. La sobreexpresi\u00f3n de miR-21 se elev\u00f3 hasta 20 veces en 46 de las 50 muestras; en miR-191 la sobreexpresi\u00f3n se elev\u00f3 hasta 200 veces en 49 de las 50 muestras, en contraste con miR-125b que mostr\u00f3 subexpresi\u00f3n de hasta cuatro veces menos, con respecto al tejido normal en 48 de las 50 muestras (figura 1).<\/p>\n

\"Fig.<\/a>

Fig. 1. Niveles de expresi\u00f3n relativa de miR-21, miR125b y miR-191 en c\u00e1ncer
de mama y tejido sano. Los niveles de expresi\u00f3n relativa y valores estad\u00edsticos
(p) de miR-21 (p=0.01), miR-125b (p=0.002) y miR-191 (p=0.0008), en
pacientes con c\u00e1ncer de mama comparados con tejido de mama sano. La l\u00ednea
punteada representa la media del nivel de expresi\u00f3n para cada miRNA.<\/p><\/div>\n

Los valores de p de los 3 miRNAs (p= 0.019 para miR-21, p=0.002 para miR-125b y p= 0.0008 para miR-191) se\u00f1alan que es posible discernir entre una muestra de c\u00e1ncer de mama comparada con tejido normal s\u00f3lo evaluando la expresi\u00f3n relativa. A partir de los valores de expresi\u00f3n relativa, se construyeron curvas ROC para cada uno de los miRNAs analizados; y se realiz\u00f3 el c\u00e1lculo del \u00e1rea bajo la curva ROC (AROC; figura 2). Con los valores de AROC se calcularon sensibilidad, especificidad, valor de predicci\u00f3n positiva (VPP), valor de predicci\u00f3n negativa (VPN) y exactitud. Los valores de sensibilidad y especificidad fueron de 75 y 60% para miR-21, 79 y 88% para miR-125b y 93 y 95% para miR-191, respectivamente. Adicionalmente, se calcularon estos valores para la combinaci\u00f3n de 2 miRNAs, siendo la sensibilidad y especificidad de 100 y 94% para la combinaci\u00f3n de miR-125b\/miR-191, y 92 y 100% para la combinaci\u00f3n de miR-21\/miR-191, respectivamente. Los valores de VPP y VPN fueron de 100 y 88% para la combinaci\u00f3n de miR-21\/miR-191, y 96 y 100% para la combinaci\u00f3n de miR-125b\/miR-191, respectivamente. Asimismo, los valores de exactitud de la prueba fueron de 98% para la combinaci\u00f3n miR-125b\/miR-191, y 95% para la combinaci\u00f3n miR-21\/miR-191. Los resultados muestran que la combinaci\u00f3n de dos miRNAs (miR-125b\/miR-191 y miR-21\/miR-191) presentaron mayor capacidad para diferenciar entre tejido de c\u00e1ncer de mama y tejido sano. (14)<\/p>\n

\"Fig.<\/a>

Fig. 2. \u00c1rea bajo la curva ROC (AROC) para miR-21, miR-125b, miR-191 y
las combinaciones de miRs. La curva muestra la sensibilidad y especificidad
para miR-21, miR-125b, miR-191, miR-125b\/miR-191 y miR-21\/miR-191.<\/p><\/div>\n

Con base en estos resultados, posteriormente se cuantificaron los niveles de expresi\u00f3n de miR-10b, miR-21, miR-125b, miR-45, miR-155, miR-186, miR-191 y miR-382 en suero sangu\u00edneo de 65 pacientes con c\u00e1ncer de mama y diez controles sanos, para determinar si existen patrones diferenciales entre ambos casos por RT-PCR tiempo real. Los resultados de los niveles de expresi\u00f3n manifestaron que en 42 muestras de sueros de pacientes con CM amplificadas satisfactoriamente para miR-10b, su totalidad present\u00f3 una sobreexpresi\u00f3n con un rango que va desde 1.5 a 11, 569.2 veces m\u00e1s que el promedio de expresi\u00f3n para las pacientes sanas. De 59 muestras amplificadas satisfactoriamente para miR-21, 56 verificaron la sobreexpresi\u00f3n con rangos de 1.1- 24, 423.8 veces m\u00e1s a los controles sanos, mientras que el resto present\u00f3 subexpresi\u00f3n con un rango de 5.6-50 veces menos al de los controles sanos. Las 40 muestras amplificadas satisfactoriamente para miR-125b se sobreexpresaron de 2.7 a 115, 777.9 veces m\u00e1s, en comparaci\u00f3n a las controles sanos.<\/p>\n

Las 18 muestras amplificadas para miR-145 se sobreexpresaron de 1.6 a 56, 423.2 veces m\u00e1s. De las 41 muestras amplificadas para miR-155, 40 se sobreexpresaron de 1.8 a 129, 716.3 veces m\u00e1s, mientras que una present\u00f3 subexpresi\u00f3n de 1.6 veces menos comparada con los controles sanos. De las 33 muestras amplificadas para miR-186, 31 presentaron sobreexpresi\u00f3n de 1.07 a 17, 817.41 veces m\u00e1s, y dos mostraron subexpresi\u00f3n de 1.6 a 2.3 veces menor que los controles sanos. De 25 muestras para miR- 191, 21 presentan sobreexpresi\u00f3n de 1.4 a 4, 138.8 veces mayor, y cuatro se subexpresan de 1.1 a 50 veces menos que en pacientes sanas. Por \u00faltimo, las 40 muestras amplificadas para miR-382 presentaron sobreexpresi\u00f3n de 2.43 a 1, 948.3 veces m\u00e1s que en pacientes sanas.<\/p>\n

En la figura 3, se muestra que la concentraci\u00f3n de ocho miRNAs fue significativamente mayor en el suero de los pacientes con CM que en el de los pacientes sanos (p < 0.001). El an\u00e1lisis de la curva ROC, llevada a cabo para evaluar el valor diagn\u00f3stico de los ocho miRNAs en suero, revel\u00f3 el potencial de tres de ellos (miR-145, miR- 155 y miR-382) como biomarcadores valiosos para la distinci\u00f3n de pacientes con CM de los pacientes sanos.<\/p>\n

Se calcul\u00f3 el valor l\u00edmite \u00f3ptimo de 59.22 para una m\u00e1xima sensibilidad y especificidad de miR-10b, en el que los valores fueron de 83.30 y 100.00%, respectivamente. El valor l\u00edmite de 6.48 para miR-21 mostr\u00f3 la sensibilidad y especificidad de 94.40 y 80.00%; en el valor l\u00edmite de 8.46 para miR-125b, la sensibilidad y especificidad fueron de 88.90 y 80.00%. En el valor l\u00edmite de 15.93 para miR-145, la sensibilidad y especificidad fueron de 94.40 y 100.00%, y en el valor l\u00edmite de 7.92 para miR-155, la sensibilidad y especificidad fueron de 94.40 y 100.00%.<\/p>\n

En el valor l\u00edmite de 9.07 para miR-186, la sensibilidad y especificidad fueron de 83.30 y 90.00%, y en el valor l\u00edmite de 11.59 para miR-191, la sensibilidad y especificidad fueron de 72.20 y 90.00%. Por \u00faltimo, en el valor l\u00edmite de 4.85 para miR-382, la sensibilidad y especificidad fueron de 94.40 y 90.00% (figura 3).<\/p>\n

\"Fig.<\/a>

Fig. 3. Niveles relativos de expresi\u00f3n de los miRNAs en el suero de pacientes
con CM. a) miR-10b, b) miR-21, c) miR-125b, d) miR-145, e) miR-155, f)
miR-191, g) miR-382, h) miR-145\/ miR-155\/ miR-382 en suero de pacientes
con c\u00e1ncer de mama (CM) y controles sanos (CS). Los valores p para todos
los microRNAs fueron significativos (p < 0.001).<\/p><\/div>\n

Para elevar el valor diagn\u00f3stico del ensayo se realiz\u00f3\u00a0la combinaci\u00f3n de las curvas ROC de miR-145,\u00a0miR-155 y miR-82. El radio de combinaci\u00f3n de\u00a0estos tres miRNAs logr\u00f3 los mayores valores de AUC\u00a0de 0.9878 (95% CI: 0.9065 a 0.9985); y en el l\u00edmite\u00a0\u00f3ptimo de 10.07, la sensibilidad y especificidad fueron\u00a0de 97.60 y 100.00%, respectivamente (figura 4).\u00a0Finalmente, la eficiencia de la prueba diagn\u00f3stica,\u00a0definida como el porcentaje de sujetos diferenciados\u00a0correctamente como enfermos de los sujetos sanos\u00a0fue de 89.3% para miR-10b, 89.3% para miR-21,\u00a089.3% para miR-125b, 96.40% para miR-145,\u00a096.40% para miR-155, 85.7% para miR-186,\u00a078.60% para miR-191, 92.90% para miR-382, y de\u00a098% para la combinaci\u00f3n de miR-145\/miR-155\/\u00a0miR-382. Estos resultados indican que el an\u00e1lisis de\u00a0tres miRNAs simult\u00e1neamente tiene un mayor potencial\u00a0diagn\u00f3stico para la detecci\u00f3n de c\u00e1ncer de\u00a0mama, en comparaci\u00f3n de la detecci\u00f3n de un solo\u00a0miRNA como biomarcador.<\/p>\n

\"Fig.<\/a>

Fig. 4. \u00c1rea bajo la curva ROC de miR-10b, miR-21, miR-125b, miR-145,
miR-155, miR-186, miR-191, miR-382 y miR-145\/miR-155\/miR-382. Cada
miRNA por separado mostr\u00f3 un menor valor de sensibilidad y especificidad
que la combinaci\u00f3n de miR-145\/miR-155\/miR-382.<\/p><\/div>\n

Los niveles s\u00e9ricos de los miR-10b, miR-21, miR-125b, miR-145, miR-155, miR-186, miR-191 y\u00a0miR-382 se analizaron en pacientes con CM en diferentes\u00a0estadios TNM de la enfermedad, para determinar si estos miRNAs podr\u00edan diferenciar entre\u00a0estadios. Los resultados no mostraron diferencia significativa\u00a0entre los niveles s\u00e9ricos de los ocho miRNAs\u00a0en los cuatro estadios analizados de la enfermedad. (15,16)\u00a0Por otro lado, tambi\u00e9n se determin\u00f3 la presencia\u00a0de los microRNAs en trofozo\u00edtos de Entamoeba\u00a0histolytica HM1-IMSS, mediante secuenciaci\u00f3n de\u00a0nueva generaci\u00f3n (NGS).<\/p>\n

De la reacci\u00f3n de secuenciaci\u00f3n se obtuvieron en\u00a0total 16, 688, 748 lecturas de secuencias sin procesar;\u00a0de \u00e9stas fueron removidas las secuencias que no\u00a0conten\u00edan el adaptador utilizado para la secuenciaci\u00f3n,\u00a0resultando en 10, 620, 021 lecturas, de las cuales\u00a0se eliminaron aqu\u00e9llas que ten\u00edan menos de 15\u00a0nucle\u00f3tidos de longitud. Finalmente, 7, 604 secuencias\u00a0fueron consideradas como contaminantes por\u00a0lo que, al eliminarse, resultaron 5, 239, 324 secuencias\u00a0nucleot\u00eddicas en total, que se consideraron como\u00a0lecturas asignables. Estas lecturas asignables se clasificaron\u00a0en grupos, y las de mayor importancia fueron\u00a0las que se pudieron alinear al genoma de E.\u00a0histolytica, adem\u00e1s, estas secuencias extendidas fueron alineadas al genoma de E. histolytica para determinar\u00a0el potencial de formar horquillas (hairpins).\u00a0En este grupo se encontraron 199 miRNAs diferentes,\u00a0con 21 nucle\u00f3tidos de longitud en promedio.<\/p>\n

Predicci\u00f3n de genes blanco regulados por miRNAs\u00a0en Entamoeba histolytica<\/strong><\/p>\n

Para determinar la funci\u00f3n probable de los miRNAs\u00a0de la amiba, se realiz\u00f3 la predicci\u00f3n de genes blanco\u00a0con el programa miRanda, (17) el cual es un algoritmo\u00a0computacional de c\u00f3digo abierto con una tasa conocida\u00a0de falsos descubrimientos. (17,18) Para el genoma\u00a0de E. histolytica existen 8, 201 genes codificantes\u00a0anotados, 90% de los cuales no tiene una 3\u2019UTR\u00a0anotada. En 10% de los genes de E. histolytica con\u00a0una regi\u00f3n 3\u2019UTR anotada, \u00e9sta es de longitud variable.\u00a0En este trabajo utilizamos 340 genes con\u00a03\u2019UTR y, para realizar un an\u00e1lisis m\u00e1s exacto, consideramos\u00a0todas las regiones 3\u2019UTR que ten\u00edan la misma\u00a0longitud. Para uniformizar esta medida, se calcul\u00f3\u00a0la media de la longitud de las regiones 3\u2019UTR,\u00a0y se le sumaron dos desviaciones est\u00e1ndar (media\u00a0observada= 140; desviaci\u00f3n est\u00e1ndar= 180).<\/p>\n

De esta manera, se extrajeron de la base de datos\u00a0secuencias de 500 nucle\u00f3tidos de 3\u2019UTR, m\u00e1s 30\u00a0nucle\u00f3tidos de la parte final de la secuencia\u00a0codificante. La energ\u00eda libre m\u00ednima (MFE) proporciona\u00a0una idea de la estabilidad de la estructura secundaria\u00a0del miRNA. Wei y colaboradores han usado\u00a0este par\u00e1metro en -14 kCal\/mol, (19) mientras que\u00a0Huang et al. han usado en -25 kCal\/mol. (20) Para este\u00a0trabajo, se eligi\u00f3 el valor intermedio de MFE, y se\u00a0fij\u00f3 en -18 kCal\/mol para llevar a cabo el an\u00e1lisis en\u00a0el algoritmo miRanda. Se obtuvieron 66 posibles\u00a0genes blanco, 32 con genes hipot\u00e9ticos y 34 con genes\u00a0con funci\u00f3n conocida. Estos resultados sugieren\u00a0que los miRNAs presentes en E. histolytica podr\u00edan\u00a0regular de uno a ocho genes diferentes. (21)<\/p>\n

DISCUSI\u00d3N<\/strong><\/p>\n

En el presente trabajo se analiz\u00f3 el perfil de expresi\u00f3n\u00a0de nueve miRNAs en tejido mamario; los\u00a0miRNAs se seleccionaron debido al an\u00e1lisis de\u00a0microarreglos que revel\u00f3 un patr\u00f3n de expresi\u00f3n diferencial\u00a0en tejido canceroso contra tejido normal.\u00a0Elegimos miR-10b, miR-125 y miR-145, porque se\u00a0encuentran menos expresados en tejido canceroso con\u00a0respecto al tejido normal; a miR-21 y miR-155, porque\u00a0se encuentran sobreexpresados en tejido maligno.\u00a0Asimismo, miR-191, miR-212 y miR-213 se\u00a0eligieron debido a que pueden predecir el grado de\u00a0invasividad del tumor.<\/p>\n

El an\u00e1lisis estad\u00edstico realizado a los resultados\u00a0obtenidos demuestra que miR-10, miR-21, miR-\u00a0125b, miR-132, miR-45, miR-212 y miR-213 evidenciaron\u00a0diferencia significativa, siendo miR-10,\u00a0miR-125b, miR-21 y miR-145 los mejores miRNAs\u00a0para el diagn\u00f3stico diferencial entre tejido sano y tejido\u00a0canceroso. Los miRNAs restantes no mostraron\u00a0diferencia significativa, aunque el an\u00e1lisis de un mayor\u00a0n\u00famero de muestras permitir\u00e1 precisar estas cifras.\u00a0La combinaci\u00f3n de dos miRNAs (mir-21\/miR-191 y miR-125b\/miR-191) mostr\u00f3 un aumento de\u00a0la sensibilidad y especificidad del ensayo, por lo que\u00a0se considera que son los mejores candidatos para utilizarse\u00a0como biomarcadores. Estos resultados obtenidos\u00a0apoyan la posibilidad de utilizar a los miRNAs\u00a0analizados como posibles biomarcadores moleculares,\u00a0ya que pueden discriminar entre tejido normal y tejido\u00a0canceroso en la mayor\u00eda de los casos analizados.<\/p>\n

Recientemente, se ha observado que los miRNAs\u00a0extracelulares que circulan en corriente sangu\u00ednea\u00a0pueden utilizarse como posibles biomarcadores para\u00a0el diagn\u00f3stico de muchas enfermedades, incluyendo\u00a0el c\u00e1ncer. (22-26) A la fecha se han realizado varios estudios\u00a0para medir los niveles de expresi\u00f3n de los\u00a0miRNAs en c\u00e1ncer de mama, tanto en tejido tumoral\u00a0como en suero y plasma. (26,27) Los resultados obtenidos\u00a0en nuestro laboratorio con el an\u00e1lisis de la expresi\u00f3n\u00a0de miRNAs en tejido de c\u00e1ncer mama fue el\u00a0punto de partida para analizar el perfil de expresi\u00f3n\u00a0de estos miRNAs en suero de pacientes con c\u00e1ncer\u00a0de mama.<\/p>\n

En la b\u00fasqueda del posible establecimiento de\u00a0nuevos biomarcadores, analizamos el perfil de expresi\u00f3n\u00a0de seis miRNAs desregulados en tejido (miR-\u00a010b, miR-21, miR-125b, miR-145, miR-155 y miR-191), mientras que miR-186 y miR-382 se incluyeron\u00a0en el an\u00e1lisis, tomando en cuenta los resultados\u00a0obtenidos en ensayos con placas TLDA (Taqman Low\u00a0Density Array) realizados en nuestro laboratorio. El\u00a0an\u00e1lisis se realiz\u00f3 en suero de 65 pacientes con c\u00e1ncer\u00a0de mama, y diez mujeres sanas (controles). La\u00a0sensibilidad y especificidad para los ocho miRNAs\u00a0analizados con un l\u00edmite \u00f3ptimo fueron de 83.30 y\u00a0100.00% para miR-10b, 94.40; 80.00% para miR-21,\u00a088.90 y 80.00 para miR-125b, 94.40 y 100.00% para\u00a0miR-145, 94.40 y 100.00% para miR-155, 83.30 y\u00a090.00% para miR-186, 72.20 y 90.00% para miR-191\u00a0y 94.40 y 90.00% para miR-382. Los resultados obtenidos\u00a0concuerdan con otros estudios que discriminan\u00a0sujetos con c\u00e1ncer y sujetos sanos. (14,28,29) Adem\u00e1s, se\u00a0detect\u00f3 que la combinaci\u00f3n de tres miRNAs (miR-145,\u00a0miR-155 y miR-382) tiene una mejor sensibilidad\u00a0(97.6%), especificidad (100%) y eficiencia (98%) que\u00a0cualquier otro miRNA analizado por separado.<\/p>\n

Por otro lado, como los miRNAs est\u00e1n involucrados\u00a0en muchos procesos de regulaci\u00f3n en la c\u00e9lula\u00a0es posible que est\u00e9n involucrados en los mecanismos\u00a0que utilizan par\u00e1sitos como E. histolytica. Sin\u00a0embargo, hasta la fecha no ha sido reportada la existencia\u00a0de miRNAs en Entamoeba histolytica. Por ello,\u00a0se plante\u00f3 el objetivo de determinar la presencia de\u00a0miRNAs en E. histolytica. Para llevar a cabo este objetivo,\u00a0se utiliz\u00f3 la secuenciaci\u00f3n de nueva generaci\u00f3n,\u00a0la cual ofrece la ventaja de cuantificar la abundancia\u00a0absoluta de los miRNAs, y adem\u00e1s permite el\u00a0descubrimiento de nuevos miRNAs. Se obtuvieron\u00a016 millones de secuencias, de las cuales s\u00f3lo poco\u00a0m\u00e1s de 5 millones fueron lecturas de alta calidad en\u00a0el genoma de E. histolytica. Se encontr\u00f3 que s\u00f3lo 0.5%\u00a0de las lecturas no fueron redundantes y se alinearon\u00a0de manera perfecta al genoma de E. histolytica, y estas\u00a0secuencias son candidatas a ser nuevos miRNAs,\u00a0debido a que su secuencia tiene el potencial de formar\u00a0una estructura de horquilla, la cual es caracter\u00edstica\u00a0de los precursores de los miRNAs.<\/p>\n

En este trabajo se identificaron por primera vez\u00a0199 miRNAs pertenecientes a E. histolytica, esto de\u00a0acuerdo a los criterios para distinguir miRNAs de\u00a0otros tipos de RNAs peque\u00f1os, (30-32) a partir del esquema\u00a0bioinform\u00e1tico propuesto en el algoritmo\u00a0ACGT101-miR v4.2.11,13 Nuestros resultados no\u00a0mostraron ninguna similitud con miRNAs conocidos\u00a0de plantas y animales. Estos resultados son consistentes\u00a0con los hallazgos observados en el alga verde\u00a0unicelular Chlamydomonas reinhardtii, la cual tambi\u00e9n\u00a0posee miRNAs, pero ninguno presenta similitud\u00a0con los miRNAs reportados hasta el momento. (33). Este resultado sugiere que los de organismos\u00a0unicelulares representan una nueva clase de miRNAs\u00a0que merecen estudiarse con amplitud. Adicionalmente,\u00a0la falta de miRNAs universalmente conservados\u00a0entre plantas, animales y algas verdes sugiere que los\u00a0genes de miRNAs pudieron haber evolucionado independientemente\u00a0en los linajes que conducen a estos\u00a0grupos. (33) Por lo tanto, la evoluci\u00f3n de E. histolytica\u00a0podr\u00eda ser similar a la de las algas verdes.<\/p>\n

Recientemente, se ha acumulado evidencia sobre\u00a0la funci\u00f3n de los miRNAs en la interacci\u00f3n hospedero-pat\u00f3geno y la regulaci\u00f3n de la respuesta inmune\u00a0contra agentes infecciosos. Debido a que los par\u00e1sitos\u00a0han coevolucionado con sus hospederos para\u00a0el establecimiento de infecciones cr\u00f3nicas y el desarrollo\u00a0de mecanismos de evasi\u00f3n, se ha postulado la\u00a0hip\u00f3tesis de que los par\u00e1sitos usan estos mecanismos\u00a0para evadir la respuesta inmune del hospedero, y\u00a0tomando en cuenta que los miRNAs no generan una\u00a0respuesta inmune, pueden transportarse libremente\u00a0v\u00eda exosomas, y regular los transcritos de las c\u00e9lulas\u00a0del hospedero. Sin embargo, a la fecha no se ha establecido\u00a0una interacci\u00f3n de esta naturaleza.(34,35) El estudio\u00a0de los miRNAs presentes en par\u00e1sitos, su expresi\u00f3n\u00a0y transporte hacia las c\u00e9lulas del hospedero\u00a0servir\u00e1 como base del establecimiento de nuevos\u00a0biomarcadores y terapias para las enfermedades producidas\u00a0por par\u00e1sitos.<\/p>\n

La b\u00fasqueda de biomarcadores informativos no\u00a0s\u00f3lo es clave para entender los procesos fisiopatol\u00f3gicos\u00a0de las enfermedades, tambi\u00e9n es fundamental\u00a0para el desarrollo terap\u00e9utico, por lo que ha sido uno\u00a0de los principales enfoques de la investigaci\u00f3n biom\u00e9dica\u00a0en las \u00faltimas dos d\u00e9cadas. A pesar de la identificaci\u00f3n\u00a0de nuevos biomarcadores basados en prote\u00ednas,\u00a0muy pocos pasan procesos realmente rigurosos\u00a0de validaci\u00f3n. Los miRNAs poseen muchas propiedades\u00a0deseables en comparaci\u00f3n con\u00a0biomarcadores de prote\u00ednas; sin embargo, requieren\u00a0los mismos procesos de validaci\u00f3n para demostrar\u00a0su especificidad y selectividad. Los desaf\u00edos fundamentales\u00a0del desarrollo de biomarcadores basados en\u00a0miRNAs son las cuestiones relacionadas con su medici\u00f3n\u00a0exacta. La creaci\u00f3n de un proceso de estandarizaci\u00f3n\u00a0para la preparaci\u00f3n de muestras y el desarrollo\u00a0de un m\u00e9todo m\u00e1s preciso para evaluar la calidad\u00a0y cantidad de los miRNAs son los desaf\u00edos del\u00a0presente. Una vez resueltos los m\u00e9todos de diagn\u00f3stico\u00a0basados en miRNAs, podr\u00edan ser una realidad\u00a0en el laboratorio cl\u00ednico.<\/p>\n

RESUMEN<\/strong><\/p>\n

Los microRNAs (miRNAs) son mol\u00e9culas de RNA\u00a0de 18 a 24 nucle\u00f3tidos de longitud involucrados en\u00a0la regulaci\u00f3n de la expresi\u00f3n g\u00e9nica a nivel\u00a0postranscripcional en la c\u00e9lula. En este trabajo analizamos\u00a0la expresi\u00f3n de miRNAs en muestras de tejido\u00a0y suero de pacientes con c\u00e1ncer mamario, y este\u00a0perfil permite distinguir pacientes con c\u00e1ncer de\u00a0mama y mujeres sanas con alta sensibilidad, especificidad\u00a0y eficiencia. La combinaci\u00f3n de dos miRNAs\u00a0para tejido y tres para suero, usados en conjunto como\u00a0un solo grupo, eleva significativamente la eficiencia\u00a0de la prueba, y demuestra que los miRNAs tienen\u00a0gran potencial como nuevos biomarcadores no\u00a0invasivos en c\u00e1ncer de mama. Adicionalmente, se\u00a0realiz\u00f3 la b\u00fasqueda de miRNAs en el protozoario\u00a0Entamoeba histolytica, por secuenciaci\u00f3n profunda,\u00a0lo que permiti\u00f3 realizar la primera descripci\u00f3n de\u00a0miRNAs en este par\u00e1sito. Se identificaron 199\u00a0miRNAs exclusivos para este par\u00e1sito, que servir\u00e1n\u00a0de base para el estudio de la regulaci\u00f3n g\u00e9nica en E.\u00a0histolytica y el establecimiento de nuevos biomarcadores\u00a0para la amibiasis.<\/p>\n

Palabras clave: miRNAs, C\u00e1ncer de mama, E.\u00a0histolytica.<\/p>\n

ABSTRACT<\/strong><\/p>\n

MicroRNAs (miRNAs) are 18 to 24 nucleotide-long\u00a0RNA molecules responsible for the regulation of gene\u00a0expression at the post-transcriptional level in the cell.\u00a0In this work, we analyzed the expression of miRNAs\u00a0in tissue samples and serum of patients with breast\u00a0cancer and we found that miRNA expression patterns\u00a0distinguish patients with breast cancer from\u00a0healthy women with high sensitivity, specificity, and\u00a0efficiency. The combination of 2 and 3 miRNAs used\u00a0as a group in tissue and serum respectively, significantly\u00a0increases the efficiency of the test and shows\u00a0that miRNAs have potential as novel noninvasive\u00a0biomarkers in breast cancer detection. Additionally,\u00a0miRNAs were detected by deep sequence in the protozoan\u00a0parasite Entamoeba histolytica, which allowed\u00a0the first description of miRNAs in this parasite. We\u00a0identified 199 new miRNAs in E. histolytica, which\u00a0are the base for the study of gene regulation and the\u00a0establishment of new biomarkers for amoebiasis.<\/p>\n

Keywords: MiRNAs, Breast Cancer, E. histolytica.<\/p>\n

AGRADECIMIENTOS<\/strong><\/p>\n

Los autores agradecen a los Cuerpos Acad\u00e9micos de\u00a0Inmunolog\u00eda y Biolog\u00eda Celular y Gen\u00e9tica de la\u00a0FCB, por su colaboraci\u00f3n multidisciplinaria y apoyo\u00a0al presente trabajo. Asimismo, a Alejandra Arreola\u00a0Triana, por la revisi\u00f3n del manuscrito, y al apoyo\u00a0financiero de los proyectos Promep:103.5\/07\/2523\u00a0y 103.5\/08\/4285. Paicyt: GCN 040-10.<\/p>\n

 <\/p>\n

*Universidad Aut\u00f3noma de Nuevo Le\u00f3n, FCB.
\ndianaresendezpr@uanl.edu.mx<\/p>\n

——————<\/p>\n

El presente art\u00edculo est\u00e1 basado en la investigaci\u00f3n \u201cDetecci\u00f3n de microRNAs extracelulares y su potencial como biomarcadores moleculares\u201d, galardonado con el Premio de Investigaci\u00f3n UANL 2014 en la categor\u00eda de Ciencias Naturales, otorgado en sesi\u00f3n solemne del Consejo Universitario de la UANL, en agosto de 2014.<\/p>\n

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Recibido: 18\/07\/14
\nAceptado: 18\/08\/14<\/p>\n

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FERM\u00cdN MAR AGUILAR*, MARIO R. MORALES VALLARTA*, CRISTINA RODR\u00cdGUEZ PADILLA*, DIANA RES\u00c9NDEZ P\u00c9REZ* CIENCIA UANL \/ A\u00d1O 18, No. 71, ENERO-FEBRERO 2015 Art\u00edculo en PDF Los biomarcadores son mol\u00e9culas que, al detectarse en tejidos biol\u00f3gicos, sirven como indicadores de las funciones normales o patol\u00f3gicas de un organismo. Un biomarcador ideal debe adaptarse a una serie de criterios en funci\u00f3n de […]<\/p>\n","protected":false},"author":2,"featured_media":0,"comment_status":"closed","ping_status":"closed","sticky":false,"template":"","format":"standard","meta":{"_monsterinsights_skip_tracking":false,"_monsterinsights_sitenote_active":false,"_monsterinsights_sitenote_note":"","_monsterinsights_sitenote_category":0,"footnotes":""},"categories":[27],"tags":[],"class_list":["post-3080","post","type-post","status-publish","format-standard","hentry","category-investigacion"],"_links":{"self":[{"href":"https:\/\/cienciauanl.uanl.mx\/index.php?rest_route=\/wp\/v2\/posts\/3080","targetHints":{"allow":["GET"]}}],"collection":[{"href":"https:\/\/cienciauanl.uanl.mx\/index.php?rest_route=\/wp\/v2\/posts"}],"about":[{"href":"https:\/\/cienciauanl.uanl.mx\/index.php?rest_route=\/wp\/v2\/types\/post"}],"author":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/cienciauanl.uanl.mx\/index.php?rest_route=\/wp\/v2\/users\/2"}],"replies":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/cienciauanl.uanl.mx\/index.php?rest_route=%2Fwp%2Fv2%2Fcomments&post=3080"}],"version-history":[{"count":9,"href":"https:\/\/cienciauanl.uanl.mx\/index.php?rest_route=\/wp\/v2\/posts\/3080\/revisions"}],"predecessor-version":[{"id":3605,"href":"https:\/\/cienciauanl.uanl.mx\/index.php?rest_route=\/wp\/v2\/posts\/3080\/revisions\/3605"}],"wp:attachment":[{"href":"https:\/\/cienciauanl.uanl.mx\/index.php?rest_route=%2Fwp%2Fv2%2Fmedia&parent=3080"}],"wp:term":[{"taxonomy":"category","embeddable":true,"href":"https:\/\/cienciauanl.uanl.mx\/index.php?rest_route=%2Fwp%2Fv2%2Fcategories&post=3080"},{"taxonomy":"post_tag","embeddable":true,"href":"https:\/\/cienciauanl.uanl.mx\/index.php?rest_route=%2Fwp%2Fv2%2Ftags&post=3080"}],"curies":[{"name":"wp","href":"https:\/\/api.w.org\/{rel}","templated":true}]}}